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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Transformação Bacteriana: O Método de Choque térmico

Overview

Transformação é o processo que ocorre quando uma célula ingere DNA estranho de seu entorno. A transformação pode ocorrer na natureza em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, a transformação é artificialmente reproduzida em laboratório através da criação de poros em membranas celulares bacterianas. Células bacterianas capazes de tirar DNA do ambiente são chamadas de células competentes. Em laboratório, as células bacterianas podem ser competentes e o DNA posteriormente introduzido por um procedimento chamado método de choque térmico.

A transformação do choque térmico usa um ambiente rico em cálcio fornecido pelo cloreto de cálcio para neutralizar a repulsão eletrostática entre o DNA plasmóide e a membrana celular bacteriana. Um aumento repentino na temperatura cria poros na membrana plasmática das bactérias e permite que o DNA plasmídeo entre na célula bacteriana. Este vídeo passa por um procedimento passo a passo sobre como criar bactérias quimicamente competentes, realizar a transformação do choque térmico, emplacar as bactérias transformadas e calcular a eficiência da transformação.

Procedure

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A transformação bacteriana é um método amplamente utilizado onde o DNA estranho é introduzido em uma bactéria, que pode então amplificar, ou clonar o DNA. Células que têm a capacidade de facilmente pegar este DNA são chamadas células competentes. Embora a transformação esteja ocorrendo naturalmente em muitos tipos de bactérias, os cientistas encontraram maneiras de induzir artificialmente e melhorar a competência de uma célula bacteriana. Neste vídeo vamos falar sobre uma dessas maneiras, a transformação do choque térmico.

Antes de falarmos sobre a técnica de choque térmico, vamos primeiro discutir o tipo de DNA mais usado na transformação bacteriana: o plasmídeo. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de dois fios que pode reduzir seu tamanho superando, de modo que pode facilmente passar por poros em uma membrana celular.

Um plasmídeo contém algumas regiões importantes que merecem ser mencionadas. Plasmids disponíveis comercialmente contêm um site de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas reconhecidas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição, que cortam DNA. Fragmentos de DNA de interesse do pesquisador podem ser inseridos no local de clonagem múltipla quando o fragmento de plasmídeo e DNA são cortados com os mesmos endonucleases.

Plasmids também contêm uma Origem da Replicação, ou ORI, que fornece informações à célula sobre onde a replicação do plasmídeo deve começar.

Além da origem da replicação e do local de clonagem múltipla, a maioria dos plasmídeos incluirá um gene de resistência a antibióticos. Este gene confere resistência a antibióticos a todas as células que contêm o plasmídeo, permitindo que essas células sobrevivam em meios que contêm antibióticos.

Agora que discutimos plasmídeos, vamos falar sobre as células em que serão introduzidas: as células competentes. O tipo de bactéria mais comumente usado em pesquisas de biologia molecular, e a transformação é e. coli, que também habita seu intestino inferior. As células são tipicamente competentes através da exposição a um ambiente rico em cálcio.

As cargas positivas dos íons de cálcio neutralizam as cargas negativas tanto do plasmídeo quanto da parede celular bacteriana dissipando a repulsão eletrostática e enfraquecendo a parede celular.

Ao expor as células a um aumento repentino na temperatura, ou choque térmico, cria-se uma diferença de pressão entre o exterior e o interior da célula, que induz a formação de poros, através do qual o DNA plasmídeo supercoilado pode entrar. Depois de devolver as células a uma temperatura mais normal, a parede celular se auto-curará.

Uma vez que as células tenham tomado o plasmídeo, eles serão capazes de crescer em placas de ágar atadas com antibiótico.

Antes de iniciar a transformação do choque térmico, limpe a área de trabalho e certifique-se de que todos os equipamentos sejam esterilizados.

Certifique-se de que você tenha mídia suficiente e ágar preparado, que fornecem a nutrição para as bactérias que você vai tornar competente. Certifique-se também de esterilizar todas as soluções via autoclaving. Deixe a mídia líquida esfriar à temperatura ambiente antes de usar e deixe o ágar esfriar a 50-55°C, a temperatura na qual o antibiótico pode ser adicionado e as placas derramadas. Deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente para solidificar.

Ao trabalhar com bactérias, deve-se sempre usar técnica asséptica para manter a esterilidade. A técnica asséptica normalmente envolve o uso de um queimador Bunsen para esterilizar instrumentos e reagentes e criar uma corrente de convecção – que mantém contaminantes no ar fora do espaço de trabalho.

Imediatamente antes da reação de choque térmico, pré-aqueça sua mídia à temperatura ambiente e placas de ágar LB contendo antibióticos até 37°C. Certifique-se também de que seu banho de água está a 42°C.

Em seguida, descongelar células quimicamente competentes no gelo.

Adicione, 1-5uL de plasmídeo frio de 1ng/μL às células bacterianas, misture suavemente e devolva a mistura de células e plasmídeos ao gelo por 30 minutos.

Quando o tempo acabar, aqueça a célula e a mistura plasmida colocando-a em um banho de água a 42°C por 30 segundos.

Imediatamente depois de tirar o tubo do banho de água coloque-o no gelo e adicione 450μL de mídia. Coloque-o em uma incubadora de agitação por 37°C por 1 hora a mais de 225 rpm para que as células possam se recuperar.

Usando técnica asséptica adequada, adicione bactérias 20-200uL a uma placa de ágar LB e espalhe o meio com um espalhador bacteriano. Incubar as placas durante a noite a 37°C de cabeça para baixo para evitar a exposição de bactérias à condensação.

No dia seguinte, as bactérias que tomaram as colônias de plasmídeos.

Em seguida, conte as colônias para calcular a eficiência da transformação, que é o número de transformadores bem sucedidos divididos pela quantidade total de DNA banhado.

Agora, colônias podem ser selecionadas para mais experimentos.

Antes de serem competentes, as bactérias utilizadas na transformação são armazenadas no congelador. Eles devem ser descongelados no gelo, espalhados em uma placa de ágar – sem antibióticos, e permitidos crescer durante a noite a 37°C.

Usando técnica asséptica, selecione uma colônia bacteriana da placa de ágar e cresça-a em uma grande cultura de 500 ml durante a noite a 37°C em uma incubadora de agitação – um instrumento, que previne a sedimentação das bactérias e até mesmo a dispersão de nutrientes na mídia.

Enquanto as células estão crescendo fazem 0,1 cloreto de cálcio molar e 0,1 cloreto de cálcio molar mais 15% de soluções de glicerol, autoclave e deixe esfriar.

As medidas de absorção são usadas para determinar se as bactérias estão ou não em sua fase de crescimento de tronco médio, o que significa que elas prontamente absorverão o DNA. Uma vez que as células tenham chegado a esta fase, coloque-as no gelo e mantenha-as lá durante todo o procedimento.

Em seguida, separe as células bacterianas em dois tubos de centrífugas grandes e gire a 4°C. Despeje sobrenaspentes e resuspend em cerca de 100 ml 0,1 molar de cloreto de cálcio frio. Em seguida, incubar células no gelo por 30 minutos. Este passo se repete pelo menos mais uma vez. Ciclos de células de fiação e resusus pendentes são frequentemente referidos como lavar suas células.

Após a lavagem final, resuspend as células em um frio 50mL 0,1 cloreto de cálcio molar mais 15% de solução de glicerol. Essas células são agora quimicamente competentes.

Distribua 50μL de bactérias em múltiplos tubos de microfuça e armazene a -80°C até ficar pronto para choque térmico.

Existem muitas aplicações e variações de transformação bacteriana.

Além do choque térmico, a eletroporação é outra técnica comum de transformação. Como o próprio nome implica, a eletroporação envolve o uso de eletricidade para fazer poros na membrana celular bacteriana através da qual o DNA pode passar.

Com relação à triagem de bactérias transformadas, os plasmídeos geralmente contêm um gene codificando a enzima beta-galactosidase para ajudar na triagem. Quando o substrato para esta enzima é incluído em placas de ágar, bactérias que foram transformadas com plasmídeos contendo uma inserção produzem colônias brancas, enquanto aquelas que não o fazem, produzem colônias azuis. Este método é referido como triagem azul e branca.

Na maioria dos experimentos de transformação, o objetivo é obter bactérias rapidamente divididas para fazer grandes quantidades de seu plasmídeo, o que inclui seu gene alvo. Após a transformação bacteriana, o próximo passo é cultivar grandes quantidades de bactérias em meio líquido contendo antibióticos e realizar a purificação plasmida, o que, como o próprio nome sugere, envolve purificar os plasmídeos das bactérias. Muitos kits comerciais estão disponíveis para este fim.

Às vezes, o objetivo da transformação é que as bactérias gerem grandes quantidades de proteína codificadas pelo plasmídeo. Aqui você vê células bacterianas sendo homogeneizadas e lístidas antes que uma técnica chamada purificação de afinidade possa ser realizada para isolar a proteína alvo. Após a purificação de grandes quantidades da proteína, pode então ser cristalizada e a estrutura da proteína particular de interesse pode ser identificada.

Você acabou de assistir JoVE Introduction to Heat Shock Transformations. Neste vídeo revisamos: o que é a transformação do choque térmico e como ela funciona, o principal por trás disso e como transformar bactérias bem sucedidas. Obrigado por assistir!

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