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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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박테리아 형질변환: 전기 천공법

Overview

용어 "변환"은 외국 DNA의 세포 섭취를 말합니다. 자연에서, 변환 박테리아의 특정 유형에서 발생할 수 있습니다. 그러나 분자 생물학에서는 세균성 세포벽에서 모공 생성을 통해 인위적으로 변형이 유도된다. 환경에서 DNA를 취할 수있는 세균 세포는 유능한 세포라고합니다. 전기유능한 세포는 실험실에서 생성될 수 있고 이들 세포의 변형은 DNA가 통과할 수 있는 세포벽에 기공을 생성하는 전기장을 적용하여 달성될 수 있다.

비디오는 전기 포라기 및 전기 기공 큐벳과 같은 전기 포기에 사용되는 장비를 설명합니다. 비디오는 또한 전자 무능한 세포및 관심있는 전기 화 세포를 만드는 방법에 대한 단계별 절차를 거칩니다. 실험의 변화의 성공 예측은 시간 상수를 관찰하여, 또한 전극시 용액에서 소금을 제거하는 것의 중요성을 언급한다.

Procedure

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세균성 변환은 박테리아가 외국 DNA를 섭취한 다음 증폭하거나 복제하는 자연발생적인 과정입니다. 실험실에서, 이 과정은 고전압 전기장 펄스를 사용하여 세균 세포막에서 모공을 생성함으로써 인위적으로 유도될 수 있으며, 이를 통해 플라스미드 DNA가 통과될 수 있다. 전기 기화는이 방법을 의미하며 다음 비디오는 원칙, 단계별 절차 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

우리가 박테리아의 전기화에 관하여 말하기 전에, 이 실험에서 사용된 DNA의 모형을 이해하는 것이 중요합니다: 플라스미드. 플라스미드는 벡터, 특정 DNA 서열의 담체역할을 하는 DNA의 작고 원형, 초염색체 조각이다.

이 서열이 해파리의 형광 단백질또는 식물의 효소를 위한 유전자이든, 다중 복제 부위 또는 MCS에게 불린 지구를 통해 플라스미드로 삽입됩니다. 이 지역에는 제한 엔도나클레스 또는 제한 효소에 의해 갈라진 특정 서열이 포함되어 있습니다. 동일한 제한 효소는 끝이 플라스미드의 새로 절단 된 끝에 보완되도록 관심의 순서를 잘라 하는 데 사용할 수 있습니다.

플라스미드에는 복제의 원점인 축약된 ORI가 포함되어 있어 복제되는 지점을 나타냅니다. 그것은 변환에 관해서 항생제 저항 유전자는 매우 중요 하다. 그 이름에서 알 수 있듯이이 유전자는 박테리아가 항생제를 포함하는 항생제에서 살아남을 수 있도록 항생제를 중화하는 효소를 생성 할 수 있습니다.

전기 기공은 전기 포레이터라는 특수 장치를 사용합니다. 전형적으로 세포는 한 번 삽입된 기계와 전기접촉을 하는 각 측면에 전극이 있는 전기기 큐벳으로 배치됩니다.

DNA와 혼합된 세균세포는 전기기공큐벳에 적재되고, 주문시 전기장은 센티미터당 1000~10,000볼트가 몇 밀리초 동안 적용된다. 이것은 막을 가로 질러 전압이 0.5-1 볼트에 도달하는 원인이 되며, 이는 모공이 형성될 수 있도록 세포막을 포함하는 인지질 이중층의 재배열로 이어질 것으로 여겨진다. 이 상태에서 플라스미드 DNA는 막을 통과하고 맥동이 완료되면 이중 층 자체를 복구합니다.

플라스미드를 복용 한 데, 박테리아는 항생제를 포함하는 천 접시에 성장할 수 있습니다.

이제 우리는 플라스미드와 전기 기전에 대해 배웠습니다. 절차가 어떻게 진행되는지 살펴보겠습니다.

DNA를 쉽게 취할 수 있는 세포는 유능한 세포로 불립니다. 분자 생물학 연구에서 변형되는 유능한 박테리아의 가장 흔한 유형은 대장균으로, 대장균은 대장균으로, 대장균은 장내 집을 만드는 원생박테리아입니다. 전기기화를 위해 준비되는 대장균은 전기능력세포라고 합니다.

박테리아를 취급할 때마다 작업 영역이 가능한 한 깨끗한지 확인하십시오.

박테리아를 취급하는 것은 또한 1개의 사례 무균 기술이 필요합니다. 일반적으로 이것은 분젠 버너의 사용을 사용하여 악기를 살균하고 대류 전류를 생성하는 것을 포함하며, 이는 공기 오염 물질을 작업 공간에서 멀리 유지합니다.

전기화 직전에, 미리 따뜻한 매체를 실온으로, 항생제를 함유한 천판을 37°C로 가져오고, 얼음 위에 차가운 전기 포기큐벳을 드십시오.

다음으로, 얼음에 전기 능력 세포를 세척 해동.

세균 세포에 소금이 없는 1ng/μL 냉소 플라스미드1-5uL을 넣고 부드럽게 섞은 다음 차가운 큐벳에 혼합물을 추가합니다. 거품이 없는지 확인합니다.

전기포레이터의 전압 및 필드 강도를 셀에 대한 올바른 설정으로 설정합니다. 여기서 는 전기 포레이터가 1700 볼트로 설정되고 17kV / cm의 필드 강도를 산출하는 것을 볼 수 있습니다.

큐벳 건조의 외부를 닦아 전기 포로이터에 배치합니다. 경고음이 들 때까지 세포를 펄스합니다.

실패한 맥동은 눈에 보이는 불꽃과 가청 팝으로 관찰 할 수있는 전기 방전을 일으킵니다. 아크라고 하는 이 방전은 유능한 세포 나 DNA에 너무 많은 소금을 가진 결과일 수 있습니다.

펄스를 적용한 후 전압이 감쇠되는 데 걸리는 시간 상수를 표시하여 변환의 성공을 예측할 수 있습니다. 소금이 존재하고 전기 기공 용액이 매우 전도성일 때, 부패가 급속하게 발생하여 방전을 일으키고 많은 세포를 죽입니다. 박테리아의 경우, 좋은 시간 상수는 5-10 밀리초범위.

맥동 직후, 큐벳을 제거하고 세포에 직접 1 ml의 미디어를 추가합니다. 매체를 포함하는 이 세포는 세포를 복구하기 위하여, 동요와 함께, 1 시간 동안 37°C에서 배양됩니다.

그런 다음, 무균 기술을 사용하여 식기 판을 함유하는 항생제에 세포의 20-200uL을 추가한다. 접시를 뒤집어 서 한천이 위에 있으므로 응축은 세포에 빠지지 않고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하지 않습니다.

플라스미드로 변형된 박테리아는 식민지를 형성해야 합니다. 식민지를 계산하고 변환 효율을 계산, 이는 DNA 도금의 총 양으로 나누어 성공적인 변압제의 수입니다.

박테리아에 영양을 공급하는 한천과 미디어는 오토클레이브를 통해 미리 준비하고 멸균해야 합니다. 액체 매체를 사용하기 전에 실온으로 식히고 한천을 50-55 °C로 식히게하십시오 - 항생제를 첨가하고 접시를 부어 수있는 온도. 그런 다음 플레이트가 실온으로 냉각되어 고화되도록 합니다.

변환에 사용되는 박테리아는 냉동실에 저장되기 때문에 먼저 얼음에 해동하고 항생제가없는 한천 판에 퍼진 다음 37 ° C에서 하룻밤 동안 재배해야합니다.

무균 기술을 사용하여 한천 판에서 세균 식민지를 선택하고 흔들리는 인큐베이터에서 37 °C에서 하룻밤 사이에 더 큰 500mL 문화에서 성장합니다.

세포가 성장하는 동안, 탈이온 화 물의 리터에 대해 준비하고 10 % 글리세롤과 물, 볼륨 용액에 볼륨을 구성합니다. 솔루션을 오토클레이브하고 4°C에서 식힙니다.

흡수성 측정은 박테리아가 성장의 그들의 중간 로그 단계에 있는지 여부를 결정하기 위하여 이용됩니다, 이는 그(것)들이 쉽게 DNA를 취할 것이라는 것을 의미합니다. 세포가이 단계에 도달하면, 얼음에 배치하고 절차 전반에 걸쳐 거기에 보관.

다음으로, 두 개의 큰 원심분리기 튜브로 분리하여 세포를 씻고 4 °C에서 회전하고, 상설물을 부어 차가운 100mL 멸균 된 물에 재연하십시오. 이 단계를 한 번 이상 반복합니다. 이 단계의 목적은 전기 기법에 강하게 영향을 미칠 소금을 제거하는 것입니다.

물에 10% 글리세롤의 50 ml에 2개의 추가 세하를 수행하고 마지막으로이 동일한 솔루션에서 박테리아를 다시 중단.

여러 Eppendorf 튜브에 세포의 50μL을 추가합니다. 이 세포는 지금 전기 기화에 사용하기 위한 준비가 되어 있고 4°C에서 유지되어야 합니다. 또는 플래시가 동결되어 -80°C에 보관할 수 있습니다.

당신이 볼 하려고, 전기 기공은 많은 응용 프로그램이 있다.

전기 포라기의 대안은 열 충격 변환으로, 세포에 DNA를 도입하기 위해 염화 칼슘과 열 모두에 박테리아의 노출에 의존합니다.

일반적으로 열 충격은 전기 화보다 박테리아에 더 부드럽고 낮은 소금이 필요하지 않습니다. 플라스미드에 표적 유전자를 삽입하는 것을 포함하는 리칭 반응은 열 충격 변환에 직접 사용될 수 있습니다. 열 충격 변환은 전기 기화보다 저렴하며 고가의 장비 나 큐벳에 의존하지 않습니다. 반면에 열 충격은 전기기화보다 낮은 변혁 효율로 이어지고 시간이 더 오래 걸립니다. 또한 세균성, 효모 및 식물 성 수막에 국한되어 전기 포유동물 세포에 전기 포기공을 적용할 수 있습니다.

여기에서 마우스 배아 섬유아세포가 전기기공큐벳에 적재되는 것을 볼 수 있습니다. 전기포이션이 완료되면, 플라스미드에 의해 인코딩된 녹색 형광 단백질을 생성하는 세포의 정도를 관찰함으로써 변환 효율성을 결정할 수 있다. 형질전환은 포유류 세포의 변형에 주어진 용어이며, 이는 전형적으로 세균 세포와 더 높은 시간 상수보다 낮은 필드 강도를 요구합니다.

전기기는 또한 여기에서 본 발달 닭 배아 같이 전체 동물에서 수행될 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 병아리의 뇌에 주입된 다음 전기 기공 프로브가 뇌 조직에 전기장을 적용하는 데 사용됩니다. 하루 이틀 후, 플라스미드에 의해 인코딩된 녹색 및 빨간색 형광 단백질은 뉴런에 의해 만들어지며 과학자들은 발달 중인 병아리 뇌의 구조적 변화를 관찰할 수 있습니다.

당신은 단지 전기 화에 의한 세균 성 변환에 대한 JoVE 소개를 지켜보았습니다. 이 비디오는 가장 일반적으로 변형된 DNA 유형으로 플라스미드를 도입하고, 전기기화의 기초로 생각되는 생체 물리학 메커니즘에 대해 논의하고, 전기 기공을 수행하기 위한 일반화 된 절차를 보여주었으며, 포유동물 시스템에서 전기 화가 어떻게 사용될 수 있는지 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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