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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Transformação Bacteriana: Eletroporação

Overview

O termo "transformação" refere-se à ingestão celular de DNA estranho. Na natureza, a transformação pode ocorrer em certos tipos de bactérias. Na biologia molecular, no entanto, a transformação é artificialmente induzida através da criação de poros nas paredes celulares bacterianas. Células bacterianas capazes de tirar DNA do ambiente são chamadas de células competentes. Células eletrocompetntes podem ser produzidas em laboratório e a transformação dessas células pode ser alcançada através da aplicação de um campo elétrico que cria poros na parede celular através do qual o DNA pode passar.

O vídeo explica o equipamento utilizado na eletroporação, como um eletroporador e cuvette eletroporação. O vídeo também passa por um procedimento passo a passo sobre como criar células eletrocompetntes e células eletroporas de interesse. Também são mencionadas a previsão do sucesso de uma transformação de um experimento, observando a constante do tempo, bem como a importância de retirar o sal das soluções ao eletroporar.

Procedure

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A transformação bacteriana é um processo natural, no qual as bactérias ingerem DNA estranho e depois amplificam ou clonam. Em laboratório, esse processo pode ser induzido artificialmente, usando pulsos de campo elétricos de alta tensão para criar poros na membrana celular bacteriana, através da qual o DNA plasmídeo pode passar. A eletroporação refere-se a este método e o vídeo a seguir demonstrará seus princípios, procedimento passo a passo e aplicações.

Antes de falarmos sobre eletroporação de bactérias, é importante entender o tipo de DNA usado nesses experimentos: o plasmídeo. Um plasmídeo é um pequeno, circular, extracromosomal pedaço de DNA que age como um vetor, um portador de sua sequência de DNA específica.

Se essa sequência é um gene para uma proteína de fluorescência em águas-vivas ou uma enzima de plantas, ela é inserida no plasmídeo através de uma região chamada local de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas que são cortadas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. As mesmas enzimas de restrição podem ser usadas para cortar sua sequência de interesse para que as extremidades sejam complementares às extremidades recém-cortadas do plasmídeo.

Os plasmídeos também contêm uma origem de replicação, ORI abreviada, que indica o ponto em que será replicado. Quando se trata de transformação, o gene de resistência a antibióticos é de vital importância. Como seu nome implica, este gene permite que as bactérias produzam uma enzima que neutraliza antibióticos permitindo que eles sobrevivam em antibióticos que contêm mídia.

A eletroporação faz uso de um dispositivo especializado chamado eletroporador. Normalmente, as células são colocadas em uma cuvette de eletroporação, que tem eletrodos de cada lado que fazem contato elétrico com a máquina uma vez inseridos.

Células bacterianas misturadas com DNA são carregadas na cuvette de eletroporação e um campo elétrico na ordem de 1000 a 10.000 volts por centímetro é aplicado por alguns milissegundos. Isso faz com que a tensão através da membrana atinja 0,5-1 volts, o que acredita-se que leve a um rearranjo da bicamada fospolipid que compreende a membrana celular de tal forma que os poros se formarão. Neste estado, o DNA plasmídeo passará pela membrana e quando o pulsamento estiver completo, a bicamada se reparará.

Tendo tomado o plasmídeo, as bactérias podem então crescer em placas de ágar contendo antibiótico.

Agora que aprendemos sobre plasmídeos e o mecanismo de eletroporação. Vamos dar uma olhada em como o procedimento é conduzido.

Células que podem facilmente tomar DNA são referidas como células competentes. O tipo mais comum de bactérias competentes que é transformada em pesquisas de biologia molecular é o E. coli, que são as bactérias procarióticas que fazem sua casa em seu intestino inferior. E. coli que são preparados para eletroporação são referidos como células eletrocompetntes.

Sempre que manusear bactérias, certifique-se de que a área de trabalho esteja o mais limpa possível.

O manuseio de bactérias também requer que uma técnica asséptica pratique. Normalmente, isso envolve o uso de um queimador Bunsen para esterilizar instrumentos e criar uma corrente de convecção – que mantém os contaminantes aéreos longe do espaço de trabalho.

Imediatamente antes da eletroporação, mídia pré-quente à temperatura ambiente, leve placas de ágar contendo antibiótico a 37°C, e cuvetas de eletroporação fria no gelo.

Em seguida, descongelar células eletrocompetente lavadas no gelo.

Adicione 1-5uL de plasmídeo frio de 1ng/μL que seja livre de sal para células bacterianas, misture suavemente e adicione a mistura ao cuvette frio. Certifique-se de que não há bolhas.

Ajuste a tensão e a força de campo do eletroporador nas configurações corretas para suas células. Aqui você vê um eletroporador sendo definido para 1700 volts e produzindo uma força de campo de 17kV/cm.

Limpe a parte externa da cuvette seca e coloque-a no eletroporador. Pulso as células até ouvir um bip.

Pulsação mal sucedida causa uma descarga elétrica, que é observável como uma faísca visível e pop audível. Esta descarga, chamada de arco, pode ser o resultado de ter muito sal em suas células competentes ou DNA.

O sucesso de sua transformação pode ser previsto observando a constante de tempo, que é a duração que leva para a tensão se deteriorar depois de aplicar o pulso. Quando o sal está presente e a solução de eletroporação é muito condutora, a decadência acontece rapidamente, causando a descarga, e assim matando muitas de suas células. Para bactérias, as constantes de tempo variam de 5 a 10 milissegundos.

Imediatamente após pulsar, remova a cuvette e adicione 1 ml de mídia diretamente às células. Esta célula contendo mídia é colocada em um tubo e incubada a 37°C por 1 hora, com agitação, para que as células se recuperem.

Em seguida, usando técnica asséptica adicione 20-200uL da célula a um antibiótico contendo placa de ágar. Inverta as placas para que o ágar esteja em cima e assim a condensação não caia em suas células e incubar durante a noite a 37°C.

Bactérias transformadas com o plasmídeo devem formar colônias. Conte as colônias e calcule a eficiência da transformação, que é o número de transformadores bem sucedidos divididos pela quantidade total de DNA banhado.

O ágar e a mídia, que fornecem a nutrição para suas bactérias, devem ser pré-preparados e esterilizados via autoclaving. Deixe a mídia líquida esfriar até a temperatura ambiente antes de usar e deixe o ágar esfriar a 50-55°C – a temperatura em que o antibiótico pode ser adicionado e as placas derramadas. Em seguida, deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente para solidificar.

Uma vez que as bactérias usadas na transformação são armazenadas no congelador, elas devem primeiro ser descongeladas no gelo, espalhadas em uma placa de ágar sem antibióticos e depois cultivadas durante a noite a 37°C.

Usando técnica asséptica selecione uma colônia bacteriana da placa de ágar e cresça-a em uma cultura maior de 500mL durante a noite a 37°C em uma incubadora de agitação.

Enquanto as células estão crescendo, prepare-se cerca de um litro de água deionizada e compor um glicerol e água de 10%, solução de volume para volume. Autoclave as soluções e deixe esfriar a 4°C.

As medidas de absorção são usadas para determinar se as bactérias estão ou não em sua fase de crescimento de tronco médio, o que significa que elas prontamente absorverão o DNA. Uma vez que as células tenham chegado a esta fase, coloque-as no gelo e mantenha-as lá durante todo o procedimento.

Em seguida, lave as células separando-as em dois tubos de centrífugas grandes e gire a 4°C, despeje sobrenaspeuta e resuspenda em água estéril estéril de 100mL fria. Repita este passo pelo menos mais uma vez. O objetivo desta etapa em particular é remover o sal, que afetará fortemente a técnica de eletroporação.

Realize duas lavagens adicionais em 50 ml de 10% de glicerol na água e, finalmente, resuspenja as bactérias nesta mesma solução.

Adicione 50μL de células em múltiplos tubos Eppendorf. Estas células estão agora prontas para uso em eletroporação e devem ser mantidas a 4°C. Ou podem ser congelados e armazenados a -80°C.

Como você está prestes a ver, a eletroporação tem muitas aplicações.

Uma alternativa à eletroporação é a transformação do choque térmico, que conta com a exposição das bactérias tanto ao cloreto de cálcio quanto ao calor, a fim de introduzir DNA em suas células.

Em geral, o choque térmico é mais suave em suas bactérias do que eletroporação e não requer pouco sal. Reações de ligadura, aquelas que envolvem inserir seu gene alvo no plasmídeo, podem ser usadas diretamente na transformação do choque térmico. A transformação do choque térmico é mais barata que a eletroporação e não depende de equipamentos caros ou cuvetas. Por outro lado, o choque térmico leva a menores eficiências de transformação do que a eletroporação e leva mais tempo. Também se limita a protoplastos bacterianos, leveduras e plantas, enquanto a eletroporação pode ser aplicada a células de mamíferos.

Aqui você vê fibroblastos embrionários de rato sendo carregados em uma cuvette de eletroporação. Uma vez que a eletroporação esteja completa, a eficiência de transformação pode ser determinada observando até que ponto as células produzem uma proteína de fluorescência verde codificada pelo plasmídeo. Transfecção é o termo dado à transformação de células mamíferas, que normalmente requer forças de campo mais baixas do que células bacterianas e maiores constantes de tempo.

A eletroporação também pode ser realizada em animais inteiros como o embrião de frango em desenvolvimento que você viu aqui. Dna plasmídeo é injetado no cérebro do filhote e, em seguida, uma sonda de eletroporação é usada para aplicar um campo elétrico ao tecido cerebral. Após um dia ou dois, proteínas fluorescentes verdes e vermelhas - codificadas pelo plasmídeo - são feitas por neurônios, e os cientistas podem observar mudanças estruturais no cérebro de filhotes em desenvolvimento.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à transformação bacteriana por eletroporação. Este vídeo introduziu o plasmídeo como o tipo mais comumente transformado de DNA, discutiu o mecanismo biofísico pensado para subjacente à eletroporação, mostrou um procedimento generalizado para a condução da eletroporação, e descreveu como a eletroporação pode ser usada no sistema mamífero. Obrigado por assistir!

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