Summary
Overview
Ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird normalerweise gemacht um die Anwesenheit und die Menge eines Zielproteins in einer experimentellen Probe nachzuweisen. Der Nachweis des Zielproteins passiert durch Antikörper, was den ELISA zu einen Immunverfahren macht. Durch eine Reihe von Inkubations- und Waschschritten erkennen die Antikörper, die oft an ein Enzym gekoppelt sind, ein Protein das an der Oberfläche einer Mikrowellplatte ist. Wenn es mit einem Substrat in Berührung kommt, bewirken die antikörpergebundenen Enzyme einen Farbwechsel, wodurch die Anwesenheit des Proteins angezeigt wird.
In diesem Video wird die Theorie hinter einem ELISA erklärt, einschließlich von primären und sekundären Antikörpern und der erforderlichen Blockierschritte. Danach folgen praktische Anwendungen mit Schritt-für-Schritt Anleitungen. Dann führen wir Variationen des ELISA Verfahrens ein, wie zum Beispiel den “Sandwich-ELISA” oder den kompetitiven ELISA. Außerdem erläutern wir Anwendungen des ELISAs, wie zum Beispiel freiverkäufliche Schwangerschaftstests.
Procedure
Das ELISA Verfahren, oder der Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ist eine häufig verwendete Methode, um zu bestimmen ob ein bestimmtes Protein vorhanden ist oder nicht.
Mit einer Reihe von Wasch- und Bindungsschritten erkennt ein Antikörper, der an ein Enzym gekoppelt ist, ein Zielprotein auf der Oberfläche einer 96-Well Platte. Wenn das Substrat zu der Probe hinzugegeben wird, tritt eine enzymatische Reaktion auf, die eine Farbänderung bewirkt mit der man das Zielprotein identifizieren und quantifizieren kann.
Bevor wir darüber sprechen wie genau man einen ELISA macht, schauen wir uns erst die Geräte und Reagenzien an, die wir brauchen.
Eine ELISA Reaktion findet typischerweise auf der Oberfläche einer flachen 96-Well Platte statt. Die flachen Wells begünstigen sowohl die optimale Verteilung der experimentellen Probe als auch die Erfassung und Detektion der Antikörper.
ELISAs können nachweisen ob bestimmte Zielproteine in wasserlöslichen Proben vorhanden sind. Häufige experimentelle Proben sind zum Beispiel Urin, Zellkulturmedium oder Blutserum.
In einem ELISA wird der Antikörper, der direkt an das Zielprotein bindet, als Primärantikörper bezeichnet. Dieser Antikörper besitzt eine hohe Affinität, das heißt dass er eng an das Epitop, also eine spezifische Region des Zielproteins, binden kann. Der primäre Antikörper ist normalerweise nicht gekennzeichnet (also nicht konjugiert).
Wie schon erwähnt binden Antikörper ihre Zielproteine meistens durch eine hohe Affinität zu einem bestimmten Epitop. Es kann jedoch möglich sein, dass die experimentelle Probe spezifische Teile von Zellen enthält, die nicht-spezifische Bindungsstellen des Antikörpers beinhalten, oder Stellen die an die konstante, also nicht Epitop-spezifische, Region des Antikörpers binden.
Daher ist es wichtig, dass man einen Blockierpuffer verwendet, der die nicht-spezifischen Bindungssplätze in der experimentellen Probe bedeckt. Sonst kann es sein das man eine enzymatische Reaktion in Wells, die nicht das Zielprotein enthalten, auslöst und dadurch falsch-positive Daten erhält.
Der Sekundärantikörper in dem ELISA Verfahren ist der Antikörper, der den Primärantikörper erkennt. Dieser Antikörper ist normalerweise an das Enzym gekoppelt. Manchmal haben die Sekundärantikörper komische Namen. Wenn zum Beispiel der Sekundärantikörper in einem Esel hergestellt wurde und einen Primärantikörper erkennt, der in einer Ziege hergestellt wurde, nennt man diesen Antikörper Esel-anti-Ziege Antikörper. Bei Sekundärantikörpern bezieht sich der erste Name auf den Organismus, in welchem der Sekundärantikörper produziert wurde, und der zweite Name auf den Organismus, in welchem der Primärantikörper hergestellt wurde.
Das Substrat, welches das aktive Zentrum des Enzyms bindet, das wiederum mit dem Sekundärantikörper konjugiert ist, wird auch noch benötigt. Die chemische Reaktion führt zu einer Farbänderung in einem anderweitig farblosen Substrat. Dieses kolometrische Verfahren erlaubt es die Anwesenheit von Zielproteinen nachzuweisen und diese zu quantifizieren.
Die enzymatische Reaktion wird auch dann fortgesetzt, wenn kein Substrat mehr vorhanden ist. Deshalb sollte man nach einer kurzen Inkubationsdauer die Stopp-Lösung hinzufügen, die wiederum eine erneute Farbänderung bewirkt und anzeigt, dass die Reaktion wirklich angehalten wurde.
Eine Mikroplattenlesegerät wird nun benutzt um die Konzentration des Zielproteins durch das Lesen der Absorbanz, das heißt der Menge des gefärbten Endprodukts, in jedem Well zu bestimmten. Die Absorbanz ist proportional zu der Menge an vorhandenem Zielprotein.
Nun das wir alle unsere Geräte haben, sind wir bereit den ELISA anzusetzen.
Um einen Standard-ELISA (oder direktes ELISA) zu machen, muss man zuerst die 96-Well Platte mit dem Zielprotein in Deckpuffer aufgelöst bedecken. Hier sollte man auch an die Positiv-und Negativkontrollen denken!
Nachdem man den Antikörper lange genug aufgetragen hat damit er komplett aufgenommen wird und sich festsetzt, kippt man die überschüssige Lösung mit einer schnellen Handbewegung weg.
Dann blockiert man die nicht-spezifischen Bindungen oder das Hintergrundsignal, durch die Zugabe von Blockierpuffer in jeden Well.
Nun kippt man den Blockierpuffer weg und wäscht die Wells kurz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 1% BSA bei Zimmertemperatur.
Während man die Wells mit PBS ausspült, bereitet man die Verdünnungen einer bekannten Konzentration von Zielprotein vor um eine Standardkurve zu generieren. Die Absorbanz der Wells der Standardkurve, die bekannte Konzentrationen des Zielproteins enthalten, werden verwendet um die Konzentration des Zielproteins in der experimentellen Probe zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf einem Vergleich der Absorbanz der Wells mit der Probe mit der Absorbanz der Wells mit der Standardkurve.
Nun gibt man den Primärantikörper hinzu!
Dann wird die Platte inkubiert (normalerweise bei Zimmertemperatur) damit genügend Zeit zur Verfügung steht das der Antikörper das Zielprotein binden kann, um ihn dann später nachweisen und quantifizieren zu können.
Nach dieser Inkubation wird der überschüssige Antikörper weggespült und die Wells werden kurz mit PBS gewaschen.
Der Sekundärantikörper wird dann auf die Platte aufgetragen und nun erneut inkubiert, normalerweise auf einer rotierenden Fläche – damit der Sekundärantikörper binden kann. Die Waschschritte werden dann wie zuvor wiederholt.
Danach gibt man das Substrat zu der Platte, um zu sehen welche Wells das Zielprotein enthalten. Die Platte sollte abgedeckt werden um sie vor Licht zu beschützen. Nach einer kurzen Inkubationszeit muss die Reaktion gestoppt werden.
Schließlich muss man die Platte in einen Mikroplattenleser schieben, der die Absorbanz – also die Menge an farbiger Lösung – in jedem Well misst. Man muss auswählen welche Wells der Leser analysieren soll. Wenn das Instrument die Platte fertig gelesen hat, wird die Absorbanz in jedem Well angezeigt.
Es ist wichtig zu wissen, dass jedes ELISA-kit eine Detektionsgrenze hat. Das heißt Proteinkonzentrationen können nur über oder unter einem bestimmten Wert bestimmt werden. Sehr geringe Proteinkonzentrationen sind normalerweise sehr nah an der Hintergrundabsorbanz, während sehr hohe Proteinkonzentrationen bedeuten können das überschüssige Antikörper oder Proteine nicht richtig weggewaschen wurden.
Weshalb will man einen ELISA eigentlich machen? Hier schauen wir uns einige häufige Anwendungen an.
Die häufigste Form des ELISA’s ist der “Sandwich”-ELISA.
In einem Sandwich-ELISA wird eine 96-Well-Platte zuerst mit einem Primärantikörper, der das Zielprotein erkennt, benetzt.
Nachdem man die überschüssige Probe weggewaschen hat, gibt man einen Sekundärantikörper hinzu, der an ein Enzym gekoppelt ist. Danach folgt das farbige Substrat.
Die Absorbanz wird dann ganz normal wie in einem normalen ELISA gemessen. In diesem Experiment zum Beispiel werden die ELISA Daten verwendet, um zu bestimmen welche Zelllinien einen Antikörper mit der höchsten Affinität – also der besten Bindung – für das Antigen bindet.
Die freiverkäuflichen Schwangerschaftstests basieren auf dem Sandwich-ELISA Verfahren.
Wenn der Urin einer potentiell schwangeren Frau zu dem Test hinzugegeben wird, reagieren enzymgekoppelte Primärantikörper, die auf dem Test angebracht sind, auf das Schwangerschaftshormon hCG, wenn es anwesend ist. Wenn die Frau schwanger ist findet die Reaktion zwischen dem Substrat und dem Enzym statt wenn die Primärantikörper durch substratgebundene Sekundärantikörper erkannt werden, und eine farbige Linie erscheint.
Eine andere Art von ELISA ist ein kompetitiver ELISA, der die Anwesenheit von Antikörpern bestimmen kann.
Wenn die Antikörper, die man untersuchen will, in einer Probe vorhanden sind, binden sie sich an das Zielprotein an der 96-Well Oberfläche. Nachdem die Enzym-gebundenen Detektionsantikörper zu der Platte hinzugegeben werden, finden diese wenige oder keine freie Proteine an die sie sich binden können, da sie “verloren” haben gegen die Antikörper die wir in der Probe nachweisen wollten.
In einem kompetitiven ELISA sind die gefärbten Wells die Proben die keinen Antikörper enthalten! Blutplasmaproben von Patienten werden typischerweise mit einem kompetitiven ELISA analysiert um bestimmte Pathogene nachzuweisen, wir zum Beispiel den HI-Virus.
Das war die Einführing in das ELISA Verfahren von JoVE. In diesem Video haben wir behandelt was ein ELISA ist und wie er funktioniert, welche Geräte und Reagenzien man braucht, und welchen Anwendungen dieses Verfahren hat. Danke für eure Aufmerksamkeit und lasst eure Substrate nicht überentwickeln.
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