Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

חיסון הקשור לאנזים (ELISA) מבוצע בדרך כלל כדי לזהות את הנוכחות ו/או הכמות של חלבון יעד של עניין בתוך מדגם ניסיוני. זיהוי חלבון היעד מתאפשר על ידי נוגדנים, מה להפוך את ELISA לחיסון. באמצעות סדרה של שלבי דגירה ושטיפה, נוגדנים אלה, המקושרים לעתים קרובות, או מצומדים, לאנזים, יזהו חלבון ציפוי בתחתית באר על צלחת microtiter. כאשר נחשף למצע, אנזים הקשור לנוגדנים יגרום לשינוי צבע, ובכך יציין את נוכחותו של חלבון העניין במדגם.

בסרטון זה, התיאוריה שמאחורי אופן העבודה של ELISAs מוסברת, כולל דיון בכריכה ראשונית ומשנית של נוגדנים וחשיבות חסימת צעדים. התיאוריה מלווה בפועל, ככל שהסרטון מתקדם להסבר על ההליך שלב אחר שלב. לבסוף, וריאציות של ELISA הסטנדרטי כגון כריך ו ELISAs תחרותי מוצגים, ויישומים בעולם האמיתי של שיטה זו, כגון בבדיקות הריון ללא מרשם מוסברים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ELISA, או חיסון הקשורים לאנזים, היא שיטה נפוצה לקביעת נוכחות או היעדר חלבון יעד ספציפי.

באמצעות סדרה של שלבי כביסה וקשירה, נוגדן מצומד, או מקושר, לאנזים יזהה חלבון מטרה בתחתית צלחת 96-well. כאשר מצע נוסף לדגימה, תתרחש תגובה אנזימטית, שתגרום לשינוי צבע המאפשר זיהוי וכימות של חלבון היעד.

לפני שנדון כיצד לבצע ELISA, בואו להכיר את הציוד ואת ריאגנטים כי תצטרך.

ההגדרה לתגובת ELISA היא בדרך כלל צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר. התחתית השטוחה של הבארות תסייע להקל על הפצה אחידה של המדגם הניסיוני שלך, כמו גם את הנוגדנים שלך ללכידה וזיהוי.

ELISAs לזהות את נוכחותם של חלבוני יעד ספציפיים בפתרונות מימיים ניסיוניים. שתן, מדיה תרבית תאים, סרום הם דגימות ניסיוניות נפוצות.

ב- ELISA, הנוגדן שנקשר ישירות לחלבון היעד הוא הנוגדן העיקרי. יש לו זיקה גבוהה, כלומר, יכולת גבוהה להיקשר בחוזקה, עבור epitope - אזור מסוים - של חלבון היעד. הנוגדן העיקרי הוא בדרך כלל ללא תווית, או ללא מצומד.

כאמור, נוגדנים נקשרים בעיקר לחלבוני היעד שלהם באמצעות זיקה גבוהה מחייבת לאפיטופ מסוים. עם זאת, המדגם הניסיוני עשוי להכיל פיסות תאים המבטאים אתרי כריכה לא ספציפיים, אתרים שיכולים לקשור את האזור הקבוע, או שאינו ספציפי לאפיטופ, של נוגדני הגלאי שלך.

לכן, תוספת של מאגר חסימה חיונית ב- ELISA כדי לכסות את כל אתרי האיגוד הלא-מדעיים בדגימות הניסיוניות שלך. אחרת ייתכן שיהיו לך תגובות אנזימטיות המתרחשות בבארות שאינן מכילות חלבון יעד, מה שנותן לך נתונים חיוביים כוזבים!

הנוגדן המשני ב- ELISA הוא הנוגדן המשמש לזיהוי הנוגדן העיקרי. הנוגדן הזה בדרך כלל מצומד לאנזים. לפעמים לנוגדן המשני יש שם פאנקי. לדוגמה, אם הנוגדן המשני עשה, או גידל, בחמור כדי לזהות נוגדן ראשוני שגדל בעז, הנוגדן המשני ייקרא נוגדן נגד עזים חמור. כשמדובר בשמות נוגדנים משניים, השם הראשון מציין את האורגניזם שיצר את הנוגדן המשני, והשם השני מייצג את האורגניזם שמייצר את הנוגדן העיקרי.

יהיה צורך גם במצע, הנקשר לאתר הפעיל של האנזים המקושר לנוגדן המשני. התגובה הכימית המתרחשת במהלך תגובה זו גורמת לשינוי צבע במצע חסר הצבעים. זה מה שנקרא מעש צבעוני מאפשר זיהוי וכימות של נוכחות של חלבון היעד.

התגובה האנזימטית תימשך כל עוד יש מצע זמין. לכן, לאחר תקופת דגירה קצרה, פתרון עצירה, שגורם לשינוי צבע נוסף כדי לציין שהתגובה למעשה נעצרה, מתווסף לבארות.

קורא מיקרופלסטיק ישמש לכימות ריכוז החלבון מעניין בכל באר על ידי קריאת הספיגה, כלומר, כמות המוצר הצבעוני, בכל באר. הספיגה פרופורציונלית לכמות חלבון היעד הקיימת.

עכשיו שיש לך את כל הציוד שלך מוכן, בואו להפעיל ELISA!

כדי לבצע תקן, או ישיר, ELISA, ראשית לכסות את בארות של צלחת 96-well עם חלבון היעד של עניין מדולל במאגר ציפוי. צלחת הפקדים החיוביים והשליליים שלך בשלב זה גם כן.

לאחר הדגירה של הצלחת המצולפת מספיק זמן כדי לתת לחלבון זמן לספיחה מוחלטת, או לצרף, לתחתית הצלחת, לזרוק את תמיסה ציפוי עודף עם נקישה מהירה של פרק כף היד שלך.

לאחר מכן, חסום כל אות איגוד או רקע לא ספציפיים על-ידי דגירה של כל באר בחסימת מאגר.

עכשיו לזרוק את חוצץ חסימה ולשטוף את בארות עם דגירה טמפרטורת החדר קצר מלוחים פוספט חוצץ, או PBS, ו 1% BSA.

בזמן שהארות נשטפות ב-PBS, הכינו דילול של ריכוז ידוע של חלבון היעד כדי ליצור עקומה סטנדרטית. ספיגת בארות העקומה הסטנדרטיות, המכילות ריכוזים ידועים של חלבון היעד, תשמש לחישוב ריכוז חלבון היעד בבארות הדגימה הניסיוניות שלכם בהתבסס על השוואה בין ספיגת בארות הדגימה לספיגת בארות העקומה הסטנדרטיות.

עכשיו הגיע הזמן להוסיף את הגילוי או הנוגדן העיקרי!

לאחר מכן, הצלחת דוגרת, בדרך כלל בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר כמות מספקת של נוגדנים להיקשר לחלבון היעד לגילוי וכימות מאוחרים יותר של החלבון.

לאחר דגירה זו, נוגדן עודף מוסר ואת הבארות נשטפים לזמן קצר עם PBS.

לאחר מכן מתווסף לצלחת נוגדן משני, והצלחת שוב דוגרת – בדרך כלל על פלטפורמה מסתובבת – כדי לאפשר לנוגדן משני להיקשר. צעדי הכביסה חוזרים על עצמם כבעבר.

לאחר מכן, הוסיפו את המצע לצלחת כדי לראות אילו בארות מכילות את חלבון היעד שלכם. לכסות את הצלחת כדי להגן על התגובה מפני אור, ולאחר מכן לאחר דגירה קצרה, לעצור את התגובה עם פתרון להפסיק.

לבסוף, מניחים את הצלחת בקורא המיקרו-לוח כדי למדוד את הספיגה או את כמות הפתרון הצבעוני, בכל באר. יהיה עליך לבחור אילו בארות ברצונך שהקורא ינתח. כאשר המכשיר יסיים לקרוא את הצלחת, תוצג קריאה של הספיגה עבור כל באר.

חשוב לציין כי לכל ערכת ELISA יש מגבלת זיהוי. כלומר, רק ריכוזי חלבון מעל ומתחת לגבולות ספציפיים ניתן לקבוע במדויק. ריכוזים קטנים מאוד של חלבון הם בדרך כלל קרובים מדי לרמות הרקע של כתמים לא ספציפיים, בעוד ריכוזים גבוהים מאוד עשויים להצביע על כך עודף חלבון או נוגדן לא נשטף כראוי במדגם זה היטב.

אז למה אתה יכול לבצע ELISA? בואו נסתכל על כמה יישומים נפוצים.

כנראה הסוג הנפוץ ביותר של ELISA שבוצע הוא כריך ELISA.

בכריך ELISA, צלחת 96 באר מצופה ראשונה בנוגדן ראשוני המזהה את חלבון היעד של עניין.

בניסוי זה, מדיה של תרבית תאים שנקצרה מקווי תאים שמייצרים נוגדנים אנושיים, הוצמדה על ידי מערכת אוטומטית על לוחות של 96 בארות מצופים מראש בנוגדן ראשוני המזהה נוגדנים אנושיים.

לאחר שטיפת הדגימה העודפת עם PBS, מתווסף נוגדן משני הקשור לאנזים, ואחריו מצע צבעוני.

הספיגה נמדדת לאחר מכן באותו אופן כמו עבור ELISA טיפוסי. לדוגמה, בניסוי זה, נתוני ELISA אלה ישמשו כדי לקבוע אילו קווי תאים לייצר את הנוגדן האנושי עם הזיקה הגבוהה ביותר עבור - כי הוא היכולת הטובה ביותר להיקשר במדויק - אנטיגן היעד שלה.

בדיקת ההריון ללא מרשם היא סוג אחד של כריך ELISA.

כאשר השתן של האישה בהריון פוטנציאלי מתווסף לבדיקה, נוגדנים ראשוניים הקשורים אנזים המצורפים לבדיקה יהיה לקשור את הורמון ההריון hCG אם הוא קיים. אם האישה בהריון, תתרחש תגובת מצע-enyzme כאשר הנוגדנים העיקריים מזוהים על ידי נוגדנים משניים הקשורים למצע באתר הבדיקה, וקו צבעוני יופיע.

סוג נוסף של ELISA הוא ELISA התחרותי, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את נוכחותם של נוגדנים.

אם הנוגדנים מעניינים נמצאים במדגם, הם ייקשרו לחלבון היעד המחובר לתחתית הצלחת. מאוחר יותר, כאשר נוגדני זיהוי הקשורים לאנזים מתווספים לצלחת, הנוגדנים הקשורים לאנזים ימצאו מעט חלבונים עד ללא קשירה; הם יהיו "מתחרים יותר" על ידי הנוגדנים של עניין במדגם הניסיוני.

ב ELISA תחרותי, אם כן, בארות צבעוניות מצביעות על הדגימות כי למעשה לא מכילים את הנוגדן של עניין! דגימות פלזמה החולה מנוהלות בדרך כלל ב ELISA תחרותי על מנת לקבוע אם נוגדנים עבור פתוגנים מסוימים, כמו וירוס HIV, נמצאים במדגם.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לביצוע אליסה. בסרטון זה סקרנו: מה זה אליסה ואיך זה עובד; איזה ציוד ריגנטים תצטרך לבצע ו ELISA; וכמה יישומים שונים של ההסתה. תודה שצפיתם, וזכרו לא לתת למצע שלכם להתגבש יתר על המידה!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter