Summary
Overview
La purification de plasmide est une technique utilisée pour isoler et purifier l'ADN plasmidique de l'ADN génomique, des protéines, des ribosomes, et du mur de la cellule bactérienne. Un plasmide est un ADN double brin petit et circulaire, qui est utilisé comme porteur de molécules spécifiques d'ADN. Lorsqu'il est introduit dans un organisme hôte via transformation, le plasmide sera répliqué, créant de nombreuses copies du fragment d'ADN à l'étude.
Dans cette vidéo, une procédure généralisée pas à pas est décrite pour montrer comment réaliser une purification de plasmide. La purification de plasmide implique trois étapes de base: la croissance de la culture bactérienne, la récolte et la lyse des bactéries, et la purification de l'ADN plasmidique. La vidéo contient une explication sur où le plasmide peut être trouvé dans chaque étape du protocole et pour analyser quantitativement et qualitativement l'ADN plasmidique avec un spectrophotomètre et/ou une électrophorèse sur gel. Il y a différents types de méthodes de purification de plasmide disponibles, qui sont dédicacées au rendement désiré, au nombre de copies de plasmide et au volume de culture bactérienne.
Procedure
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires et extra-chromosomiques. En biologie moléculaire, ils agissent comme porteurs, ou vecteurs, pour un fragment d'ADN spécifique. Des bactéries sont utilisées pour répliquer les plasmides, de sorte que votre ADN d'intérêt soit produit en masse. Le procédé par lequel les chercheurs obtiennent les plasmides depuis les bactéries est appelé la purification de plasmide, qui sera expliquée dans cette vidéo.
De façon évidente, la purification de plasmide implique la purification des plasmides, mais qu'est-ce-que cela signifie exactement? Pour purifier des plasmides, ils doivent être isolés du chromosome bactérien, des protéines, de la membrane bactérienne et des ribosomes bactériens.
Bien que de nombreux kits différents existent pour purifier les plasmides, le principe de base derrière la purification de plasmide reste le même pour tous. Tout d'abord, la colonnie bactérienne sélectionnée est cultivée dans un milieu de culture approprié qui contient les antibiotiques necessaires. Grâce à un gène de résistance aux antibiotiques, codé par le plasmide, seules les bactéries contenant le plasmide vont croitre dans ce milieu. Les bactéries sont récoltées et lysées à un pH élevé. Le pH est neutralisé, du sel est ajouté, puis le mélange est centrifugé pour retirer les débris et l'ADN génomique.
Le lysat cellulaire neutralisé est ajouté dans une colonne de silice. Il est communément considéré que l'ADN plasmidique se lie à la colonne via un mécanisme appelé échange d'anions, où l'ADN, un anion fort, se lie avec la colonne chargée négativement, via un pont de sels de cations. Les autres substances du lysat, telles que les protéines, sont lavées à travers la colonne avec des tampons hautement salés. Finalement, le plasmide purifié est libéré de la colonne lorsqu'un tampon faiblement salé est ajouté, interrompant le pont de sels.
Pour cette procédure un tablier de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection doivent être portés.
Les cultures bactériennes, qui sont transformées avec l'ADN plasmidique désiré, doivent être cultivées pendant la nuit dans un milieu de croissance avec l'antibiotique approprié dans un incubateur à agitation à 37 °C.
Le jour suivant, la culture de bactéries est granulée par centrifugation et le supernageant est retiré. Le pellet restant est remis en suspension dans un tampon de remise en suspension.
Une fois remises en suspension, les bactéries peuvent être transférées vers un tube plus petit où le tampon de lyse est ajouté. Le tampon de lyse a un pH élevé et contient des détergents, tel que le dodécylsulfate de sodium, qui perturbent les membranes bactériennes, permettant ainsi la lyse des bactéries. La solution devient trouble avec l'ajout du tampon de lyse et après mélange, la solution devient plus claire. La solution ne doit pas être mélangée en vortex à cause de la possibilité de cisaillement, ou cassure en morceaux, de l'ADN génomique, qui pourrait alors contaminer la purification de l'ADN plasmidique.
Ensuite, le tampon de neutralisation est ajouté, pour neutraliser les conditions alcalines et diminuer le pH. Avec une agitation douce, l'ADN génomique ainsi que n'importe quelles protéines liées à lui vont précipiter, pendant que l'ADN plasmidique restera en solution. Une fois encore évitez d'agiter en vortex, de manière à ce que vos plasmides soient libres de contamination par de l'ADN génomique.
Le mélange est ensuite centrifugé et le précipité ADN génomique/protéine est pelleté. Le supernageant contient l'ADN plasmidique ainsi que des protéines solubles.
Ce supernageant est placé dans la colonne par soutirage, un nom de fantaisie pour tirage, ou pipetage. Les pellets peuvent être jetés.
Ensuite, le tampon de lavage a haute teneur en sel passe à travers la colonne pendant que l'ADN reste lié à la silice. Les étapes de lavage répétées avec un tampon hautement salé retirent les endonucléases, l'ARN, les protéines, les colorants, et les impuretés de faible poids moléculaire. L'écoulement continu des étapes de lavage devrait être jeté. Après l'étape finale de lavage, vérifiez que le filtre est complètement sec sans aucun reste de tampon. L'ADN plasmidique est encore localisé sur le filtre.
L'ADN plasmidique est élué avec de l'eau stérile ou un tampon d'élution. L'ADN est rapidement disponible pour utilisation immédiate dans une large gamme d'applications.
Il y a plusieurs moyens de vérifier la pureté des plasmides après purification. Un spectromètre peut être utilisé pour comparer l'absorbance à différentes longueurs d'ondes pour déterminer la concentration en ADN plasmidique. Une analyse sur gel d'agarose de plasmide purifié peut déterminer si le plasmide est de taille conforme et s'il n'y a pas de contaminants. Cette étape assure qu'il n'y ait pas de contamination par l'ADN génomique et que le plasmide n'ait pas été modifié en bactérie.
La procédure de purification de plasmide peut être modifiée pour s'adapter à différentes tailles de plasmide, nombre de copies, volume de culture, et peut inclure différents équipements pour les étapes d'attache, de lavage et d'élution. Le rendement s'avère être une des plus importantes distinctions entre les préparations de plasmide, qui sont souvent divisés entre la minipréparation, ou miniprep, la midiprep, la maxiprep, et la megaprep en fonction du rendement désiré.
En terme d'utilisations en aval, la transfection est une procédure qui suit généralement la purification de plasmide. Elle implique l'introduction d'ADN plasmidique dans des cellules eucaryotes. Le but d'une expérience de transfection est souvent de visualiser la strucure des cellules et des tissus avec des protéines rapportrices, tels que ces étiquetages de neurones dans les images que vous voyez ici.
Parfois de multiple plasmides purifiés par plusieurs actions de purification peuvent être introduits dans la même bactérie, reproduisant ainsi une voie entière de biosynthèse via la production d'enzymes codés par les plasmides. Le résultat final est la fabrication d'un composé complexe, comme l'antibiotique que vous voyez ici, par la cellule.
Les plasmides purifiés peuvent être réintroduits dans les bactéries, en vue de générer une grande quantité de protéines codées par le plasmide. Ici vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées avant qu'une technique appellée purification par affinité puisse être réalisée pour isoler la protéine cible. La protéine purifiée est crystalisée et sa structure est ensuite identifiée.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la purification de plasmide. Dans cette vidéo nous avons parlé des principes de base derrière la méthode, sa description pas à pas et une poignée d'applications de votre préparation de plasmide. Comme toujours, merci pour votre attention!
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
