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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Purificazione del plasmide

Overview

La purificazione del plasmide è una tecnica utilizzata per isolare e purificare il DNA plasmidico dal DNA genomico, dalle proteine, dai ribosomi e dalla parete cellulare batterica. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che viene utilizzato come vettore di specifiche molecole di DNA. Quando introdotto in un organismo ospite attraverso la trasformazione, un plasmide verrà replicato, creando numerose copie del frammento di DNA in studio.

In questo video, viene descritta una procedura generalizzata passo-passo su come eseguire la purificazione del plasmide. La purificazione del plasmide comprende tre fasi fondamentali: crescita della coltura batterica, raccolta e lisi dei batteri e purificazione del DNA plasmidico. Il video contiene una spiegazione in cui il plasmide può essere trovato in ogni fase del protocollo e per analizzare quantitativamente e qualitativamente il DNA del plasmide con uno spettrofotometro e / o un'elettroforesi su gel. Esistono diversi tipi di metodi di purificazione del plasmide disponibili, che sono orientati verso la resa desiderata, il numero di copie del plasmide e il volume della coltura batterica.

Procedure

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I plasmidi sono molecole circolari, extra cromosomiche, di DNA e in biologia molecolare fungono da vettori, o vettori, per uno specifico frammento di DNA. I batteri vengono utilizzati per replicare i plasmidi, in modo che il DNA di interesse sia prodotto in serie. Il processo attraverso il quale i ricercatori ottengono plasmidi dai batteri è chiamato purificazione dei plasmidi, che sarà spiegato in questo video.

Ovviamente, la purificazione dei plasmidi comporta la purificazione dei plasmidi, ma cosa significa esattamente? Per purificare i plasmidi, devono essere isolati dal cromosoma batterico, dalle proteine, dalla membrana batterica e dai ribosomi batterici.

Sebbene esistano molti kit diversi per purificare i plasmidi, il principio di base alla base della purificazione dei plasmidi rimane lo stesso per tutti. In primo luogo, la colonia batterica selezionata viene coltivata in un mezzo di coltura appropriato che contiene gli antibiotici corretti. Grazie a un gene di resistenza agli antibiotici, codificato dal plasmide, solo i batteri contenenti il plasmide cresceranno in questo mezzo. I batteri vengono raccolti e llisi sotto un pH elevato. Il pH viene neutralizzato, viene aggiunto sale e quindi la miscela viene filata verso il basso per rimuovere detriti e DNA genomico.

Il lisato cellulare neutralizzato viene aggiunto su una colonna di silice. Si ritiene che il DNA plasmidico aderisca alla colonna attraverso un meccanismo chiamato scambio anionico, in cui il DNA, un anione forte, si lega alla colonna caricata negativamente attraverso un ponte di sale cationico. Altri materiali del lisiato, come le proteine, vengono lavati attraverso la colonna con alti tamponi salini. Infine, il plasmide purificato viene rilasciato dalla colonna quando viene aggiunto un tampone a basso contenuto di sale interrompendo il ponte di sale.

Per questa procedura è necessario indossare un cappotto da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi.

Le colture batteriche, che vengono trasformate con il DNA plasmidico desiderato, devono essere coltivate durante la notte in mezzi di crescita con un antibiotico appropriato in un incubatore vibrante a 37 ° C.

Il giorno successivo, la coltura batterica viene pellettata mediante centrifugazione e il surnatante viene rimosso. Il pellet rimanente viene riconsospendato nel tampone di lisi.

Una volta riconsegati, i batteri possono essere trasferiti in un tubo più piccolo dove viene aggiunto il tampone di lisi. Il tampone di lisi ha un pH elevato e contiene detergenti, come il sodio dodecil solfato, che interrompono le membrane batteriche, lysando così i batteri. La soluzione diventerà torbia con l'aggiunta del tampone di lisi e dopo la miscelazione la soluzione diventa più chiara. La miscela non deve essere vortexata a causa della possibilità di tosare, o rompere, il DNA genomico, che potrebbe quindi contaminare la purificazione del DNA plasmidico.

Quindi, viene aggiunto un tampone di neutralizzazione per neutralizzare le condizioni alcaline e abbassare il pH. Con una delicata miscelazione il DNA genomico e tutte le proteine ad esso legate precipiteranno, mentre il DNA plasmidico rimarrà in soluzione. Ancora una volta evita il vortice, in modo che i tuoi plasmidi siano privi di contaminazione genomica del DNA.

La miscela viene quindi centrifugata e il precipitato genomico DNA/proteina viene pellettato. Il surnatante contiene il DNA plasmidico e proteine solubili.

Questo surnatante viene posizionato sulla colonna decantando, un nome di fantasia per versarlo o pipettare. Il pellet può essere scartato.

Successivamente, il tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale passa attraverso la colonna mentre il DNA rimane legato alla silice. Le ripetute fasi di lavaggio con tampone salino alto rimuovono endonucleasi, RNA, proteine, coloranti e impurità a basso peso molecolare. Il flusso delle fasi di lavaggio deve essere scartato. Dopo l'ultima fase di lavaggio assicurarsi che il filtro sia completamente asciutto senza che rimanga alcun tampone. Il DNA plasmidico si trova ancora sul filtro.

Il DNA del plasmide viene eluito con acqua sterile o un tampone di eluizione. Il DNA è facilmente disponibile per l'uso immediato in una vasta gamma di applicazioni.

Esistono diversi modi per verificare la purezza dei plasmidi dopo la purificazione. Uno spettrometro può essere utilizzato per confrontare l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda per determinare la concentrazione di DNA plasmidico. Un'analisi del gel di agarose del plasmide purificato può determinare se il plasmide ha le dimensioni corrette e non ci sono contaminanti. Questo passaggio garantisce che non vi sia alcuna contaminazione genomica del DNA e che il plasmide non sia stato modificato nei batteri.

La procedura di purificazione del plasmide può essere modificata per adattarsi a diverse dimensioni del plasmide, numero di copie, volume di coltura e può includere diverse attrezzature per le fasi di legatura, lavaggio ed eluizione. La resa sembra essere una delle distinzioni più importanti tra i preparati plasmidici e sono spesso divisi in minipreparazione, o miniprep, midiprep, un maxiprep e un megaprep a seconda della resa desiderata.

In termini di applicazioni a valle, una procedura che segue comunemente la purificazione dei plasmidi è la trasfezione, che comporta l'introduzione del DNA plasmidico nelle cellule eucariotiche. Spesso l'obiettivo di un esperimento di trasfezione è quello di visualizzare la struttura di cellule e tessuti con proteine reporter, come quelle che etichettano i neuroni nelle immagini che vedete qui.

A volte più plasmidi purificati da diversi prep di purificazione possono essere introdotti negli stessi batteri, riproducendo così un'intera via biosintetica attraverso la produzione di un numero di enzimi codificati dai plasmidi. Il risultato finale è la produzione di un composto complesso, come l'antibiotico che vedete qui, da parte della cellula.

I plasmidi purificati possono essere reintrodotti nei batteri, al fine di generare grandi quantità di proteine codificate dal plasmide. Qui si vedono le cellule batteriche omogeneizzate e lizzate prima che una tecnica chiamata purificazione dell'affinità possa essere eseguita per isolare la proteina bersaglio. La proteina purificata viene cristallizzata e la sua struttura viene quindi identificata.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla purificazione dei plasmidi. In questo video abbiamo discusso i principi di base alla base di questo metodo, la sua descrizione passo passo e una manciata di applicazioni della preparazione del plasmide. Come sempre, grazie per aver guardato!

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