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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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플라스미드 정제

Overview

플라스미드 정제는 게놈 DNA, 단백질, 리보솜 및 세균세포벽으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 정화하는 데 사용되는 기술입니다. 플라스미드는 특정 DNA 분자의 담체로 사용되는 작고 원형의 이중 좌초 DNA입니다. 변환을 통해 숙주 유기체로 도입될 때, 플라스미드가 복제되어 연구 하에 DNA 단편의 수많은 사본을 만듭니다.

이 비디오에서는 플라스미드 정화를 수행하는 방법에 대해 단계별 일반화 절차가 설명되어 있습니다. 플라스미드 정제에는 세균 배양의 성장, 박테리아의 수확 및 용해, 플라스미드 DNA의 정화 의 세 가지 기본 단계가 포함됩니다. 이 비디오에는 플라스미드가 프로토콜의 각 단계에서 발견될 수 있는 설명이 포함되어 있으며 분광계 및/또는 겔 전기포고증으로 플라스미드 DNA를 정량적으로 그리고 질적으로 분석할 수 있습니다. 원하는 수율, 플라스미드 카피 번호 및 세균 배양 부피를 대상으로 하는 다양한 유형의 플라스미드 정제 방법이 있습니다.

Procedure

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플라스미드는 원형, 여분의 염색체, DNA 분자 및 분자 생물학에서 특정 DNA 단편을 위해 운반대, 또는 벡터로 작용합니다. 박테리아는 플라스미드를 복제하는 데 사용되므로 관심있는 DNA가 대량 생산됩니다. 연구원이 박테리아에서 플라스미드를 얻는 과정은 플라스미드 정제라고하며, 이 비디오에서 설명 될 것입니다.

분명히, 플라스미드 정화는 플라스미드를 정화하는 것을 포함하지만, 정확히 무엇을 의미합니까? 플라스미드를 정화하려면 세균 염색체, 단백질, 세균성 막 및 세균성 리보솜으로부터 분리되어야 합니다.

플라스미드정화를 위한 다양한 키트가 존재하지만, 플라스미드 정화의 기본 원리는 모두에게 동일하게 유지됩니다. 첫째, 선택된 세균성 식민지는 올바른 항생제를 포함하는 적당한 배양 매체에서 성장합니다. 플라스미드에 의해 인코딩된 항생제 내성 유전자 덕분에 플라스미드를 함유한 박테리아만 이 미디어에서 자랄 것입니다. 박테리아는 높은 pH에서 수확 하 고 lysed. pH는 중화되고, 소금이 첨가되고, 혼합물은 이물질과 게놈 DNA를 제거하기 위해 아래로 돌린다.

중화 셀 리세이트를 실리카 컬럼에 첨가한다. 플라스미드 DNA는 음이온 교환이라는 메커니즘을 통해 컬럼을 준수하는 것으로 추정되며, 여기서 강력한 음이온인 DNA는 양이온 염교를 통해 음전하 컬럼에 결합합니다. 단백질과 같은 lysate의 다른 물질은 높은 염완충액으로 컬럼을 통해 세척됩니다. 마지막으로, 낮은 염분 완충제가 첨가되어 소금 다리를 방해하는 정제 된 플라스미드가 컬럼에서 방출됩니다.

이 절차를 위해 실험실 코트, 일회용 장갑과 보호 고글을 착용해야합니다.

원하는 플라스미드 DNA로 변형되는 세균 배양은 37°C 흔들리는 인큐베이터에서 적절한 항생제로 성장 미디어에서 하룻밤 사이에 재배되어야 합니다.

다음 날, 박테리아 배양은 원심분리에 의해 펠릿되고 상체는 제거됩니다. 나머지 펠릿은 리시스 버퍼에서 다시 일시 중단됩니다.

일단 다시 중단되면, 박테리아는 lysis 완충액이 추가되는 더 작은 관으로 옮겨질 수 있습니다. 리시스 버퍼는 높은 pH를 가지고 있으며 박테리아 막을 방해하는 나트륨 도데실 황산염과 같은 세제를 함유하여 박테리아를 분해합니다. 용액은 용해 버퍼를 추가하여 흐리게 되고 솔루션을 혼합한 후 더 명확해집니다. 혼합물은 전단의 가능성으로 인해 소용돌이해서는 안됩니다, 또는 분리, 게놈 DNA, 이는 다음 플라스미드 DNA 정화를 오염 시킬 수 있습니다.

그런 다음 중화 버퍼가 첨가되어 알칼리성 조건을 중화하고 pH를 낮춥춥니까. 페놈 DNA뿐만 아니라 그것에 묶인 어떤 단백질든지 온화한 혼합으로 침전됩니다, plasmid DNA는 해결책에 머물 것입니다 동안. 다시 한번 소용돌이를 피하므로 플라스미드는 유전체 DNA 오염이 없습니다.

혼합물은 원심분리되고 게놈 DNA/단백질 침전제가 펠릿화됩니다. 상체에는 플라스미드 DNA와 수용성 단백질이 포함되어 있습니다.

이 상체는 디캔팅, 그것을 쏟아 붓거나 파이펫팅을 위한 멋진 이름인 디캔팅으로 열에 배치됩니다. 펠릿은 버릴 수 있습니다.

다음으로, 높은 소금 세척 버퍼는 DNA가 실리카에 묶여 있는 동안 컬럼을 통과합니다. 높은 소금 완충액을 가진 반복적인 세척 단계는 엔토몰리스, RNA, 단백질, 염료 및 저분자 중량 불순물을 제거합니다. 세척 단계의 흐름을 폐기해야 합니다. 마지막 세척 단계 후에 필터가 버퍼가 남지 않고 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 플라스미드 DNA는 여전히 필터에 있습니다.

플라스미드 DNA는 멸균물 또는 용출 완충제로 용출됩니다. DNA는 응용 프로그램의 넓은 범위에서 즉시 사용하기 위해 쉽게 사용할 수 있습니다.

정화 후 플라스미드의 순도를 확인하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 분광계는 플라스미드 DNA의 농도를 결정하기 위해 다른 파장에서 흡광도를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 정제 된 플라스미드의 아가로즈 겔 분석은 플라스미드가 올바른 크기이고 오염 물질이 없는지 확인할 수 있습니다. 이 단계는 게놈 DNA 오염이 없고 플라스미드가 박테리아에서 수정되지 않았는지 확인합니다.

플라스미드 정화 절차는 상이한 플라스미드 크기, 복사 번호, 배양 량을 수용할 수 있도록 수정할 수 있으며 바인딩, 세척 및 용출 단계에 대한 다양한 장비를 포함할 수 있다. 수율은 플라스미드 제제 사이의 가장 눈에 띄는 구별 중 하나이며 종종 미니 준비, 또는 미니 준비, 미디프, 맥시프레프 및 원하는 수율에 따라 메가 프레폰으로 나뉩니다.

다운스트림 응용 프로그램의 관점에서, 일반적으로 플라스미드 정제를 따르는 한 절차는 진핵 세포로 플라스미드 DNA의 도입을 포함하는 형질입니다. 종종 형질 전환 실험의 목표는 여기에서 볼 수있는 이미지에서 뉴런을 표시하는 것과 같은 기자 단백질을 가진 세포 및 조직의 구조를 시각화하는 것입니다.

때로는 여러 정화 준비에 의해 정제 된 여러 플라스미드가 동일한 박테리아로 도입 될 수 있으며, 따라서 플라스미드에 의해 인코딩 된 다수의 효소의 생산을 통해 전체 생합성 경로를 재현할 수 있습니다. 최종 결과는 세포에 의해, 여기에서 보는 항생제 같이 복잡한 화합물의 제조입니다.

정제 된 플라스미드는 플라스미드에 의해 인코딩 된 많은 양의 단백질을 생성하기 위해 박테리아로 다시 유입 될 수 있습니다. 여기서 세균세포가 균질화되고 용해되는 것을 볼 수 있으며, 친화 정화라는 기술이 표적 단백질을 분리하기 위해 수행될 수 있다. 정제 된 단백질은 결정화되고 그 구조는 그 때 확인됩니다.

당신은 방금 Plasmid 정화에 대한 JoVE의 소개를 지켜보았습니다. 이 비디오에서는 이 방법의 기본 원칙, 단계별 설명 및 몇 가지 플라스미드 준비 응용 프로그램에 대해 논의했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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