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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Purificação plasmida

Overview

Purificação plasmida é uma técnica usada para isolar e purificar DNA plasmídeo do DNA genômico, proteínas, ribossomos e a parede celular bacteriana. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de dois fios que é usado como portador de moléculas específicas de DNA. Quando introduzido em um organismo hospedeiro via transformação, um plasmídeo será replicado, criando numerosas cópias do fragmento de DNA em estudo.

Neste vídeo, um procedimento generalizado passo a passo é descrito como realizar a purificação plasmida. A purificação plasmida inclui três passos básicos: crescimento da cultura bacteriana, colheita e lise das bactérias, e purificação do DNA plasmídeo. O vídeo contém uma explicação onde o plasmídeo pode ser encontrado em cada etapa do protocolo e analisar quantitativa e qualitativamente DNA plasmídeo com um espectotómetro e/ou eletroforese gel. Existem diferentes tipos de métodos de purificação plasmídeos disponíveis, que são voltados para o rendimento desejado, número de cópia plasmida e volume de cultura bacteriana.

Procedure

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Plasmídeos são circulares, cromossômicos extras, moléculas de DNA e na biologia molecular atuam como portadores, ou vetores, para um fragmento específico de DNA. Bactérias são usadas para replicar plasmídeos, de modo que seu DNA de interesse é produzido em massa. O processo pelo qual os pesquisadores obtêm plasmídeos de bactérias é chamado de purificação plasmida, que será explicado neste vídeo.

Obviamente, purificação plasmida envolve purificar plasmídeos, mas o que isso significa exatamente? Para purificar plasmídeos, eles devem ser isolados do cromossomo bacteriano, proteínas, membrana bacteriana e ribossomos bacterianos.

Embora existam muitos kits diferentes para purificar plasmídeos, o princípio básico por trás da purificação plasmida permanece o mesmo para todos. Primeiro, a colônia bacteriana selecionada é cultivada em uma mídia cultural apropriada que contém os antibióticos corretos. Graças a um gene de resistência a antibióticos, codificado pelo plasmídeo, apenas bactérias contendo o plasmídeo crescerão nesta mídia. As bactérias são colhidas e lísmidas sob um pH alto. O pH é neutralizado, o sal é adicionado, e então a mistura é girada para baixo para remover detritos e DNA genômico.

O liseto de célula neutralizada é adicionado em uma coluna de sílica. Acredita-se que o DNA plasmídeo adere à coluna através de um mecanismo chamado troca de ânion, onde o DNA, um ânion forte, se liga à coluna carregada negativamente através de uma ponte de sal de origem. Outros materiais do lisato, como proteínas, são lavados através da coluna com tampões de sal elevados. Finalmente, o plasmídeo purificado é liberado da coluna quando um tampão de sal baixo é adicionado interrompendo a ponte de sal.

Para este procedimento deve ser usado um jaleco, luvas descartáveis e óculos de proteção.

As culturas bacterianas, que são transformadas com o DNA plasmídeo desejado, devem ser cultivadas da noite para o dia em meios de crescimento com antibiótico apropriado em uma incubadora de agitação de 37°C.

No dia seguinte, a cultura das bactérias é pelotada pela centrifugação e o supernante é removido. A pelota restante é resuspensada em tampão de lise.

Uma vez resuspended, as bactérias podem ser transferidas para um tubo menor onde o tampão de lise é adicionado. O tampão de lise tem um pH alto e contém detergentes, como sulfato de dodecyl de sódio, que interrompem as membranas bacterianas, assim, alise das bactérias. A solução ficará nublada com a adição do tampão de lise e após a mistura a solução fica mais clara. A mistura não deve ser vórtice devido à possibilidade de tesourar, ou quebrar, DNA genômico, que poderia então contaminar a purificação de DNA plasmídeo.

Em seguida, o tampão de neutralização é adicionado para neutralizar as condições alcalinas e diminuir o pH. Com dna genômico de mistura suave, bem como quaisquer proteínas ligadas a ele precipitarão, enquanto o DNA plasmídeo permanecerá em solução. Mais uma vez evite vórtices, assim como seus plasmídeos estão livres de contaminação genômica de DNA.

A mistura é então centrifuada e o DNA/proteína genômica precipitado é pelleted. O supernante contém o DNA plasmídeo, bem como proteínas solúveis.

Este supernatante é colocado na coluna por decantação, um nome chique para despejá-lo, ou pipetting. A pelota pode ser descartada.

Em seguida, o tampão de lavagem de sal passa pela coluna enquanto o DNA permanece ligado à sílica. Passos repetidos de lavagem com tampão de sal alto remove endonucleases, RNA, proteínas, corantes e impurezas de baixo peso molecular. O fluxo das etapas de lavagem deve ser descartado. Após a etapa final de lavagem, certifique-se de que o filtro está completamente seco sem que haja nenhum buffer restante. O DNA plasmídeo ainda está localizado no filtro.

O DNA plasmídeo é elucido com água estéril ou um tampão de eluição. O DNA está prontamente disponível para uso imediato em uma ampla gama de aplicações.

Há uma série de maneiras de verificar a pureza dos plasmídeos após a purificação. Um espectrômetro pode ser usado para comparar a absorvência em diferentes comprimentos de onda para determinar a concentração de DNA plasmídeo. Uma análise de gel de agarose do plasmídeo purificado pode determinar se o plasmídeo é do tamanho correto e não há contaminantes. Esta etapa garante que não haja contaminação genômica de DNA e que o plasmídeo não tenha sido modificado em bactérias.

O procedimento de purificação plasmid pode ser modificado para acomodar diferentes tamanhos plasmídeos, número de cópia, volume de cultura, e pode incluir diferentes equipamentos para as etapas de ligação, lavagem e elução. O rendimento passa a ser uma das distinções mais proeminentes entre preparações plasmidas e muitas vezes são divididos na minipreparação, ou miniprep, o midiprep, um maxiprep, e um megaprep dependendo do rendimento desejado.

Em termos de aplicações a jusante, um procedimento que comumente segue a purificação plasmida é a transfecção, que envolve a introdução de DNA plasmídeo em células eucarióticas. Muitas vezes o objetivo de um experimento de transfecção é visualizar a estrutura de células e tecidos com proteínas repórteres, como aquelas que rotulam os neurônios nas imagens que você vê aqui.

Às vezes, vários plasmídeos purificados por vários preparadores de purificação podem ser introduzidos nas mesmas bactérias, reproduzindo assim uma via biossintética inteira através da produção de uma série de enzimas codificadas pelos plasmídeos. O resultado final é a fabricação de um composto complexo, como o antibiótico que você vê aqui, pela célula.

Plasmídeos purificados podem ser reintroduzidos em bactérias, a fim de gerar grandes quantidades de proteína codificada pelo plasmídeo. Aqui você vê células bacterianas sendo homogeneizadas e lístidas antes que uma técnica chamada purificação de afinidade possa ser realizada para isolar a proteína alvo. A proteína purificada é cristalizada e sua estrutura então identificada.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à purificação plasmida. Neste vídeo discutimos os princípios básicos por trás deste método, sua descrição passo a passo e um punhado de aplicações de sua preparação plasmida. Como sempre, obrigado por assistir!

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