Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

טיהור ג'ל משמש לשחזור שברי DNA לאחר הפרדה אלקטרופורטית. שחזור DNA מג'ל אגרוז כולל שלושה שלבים בסיסיים: כריכה, כביסה ואלגנטיות מעמוד סיליקה. DNA הוא האמין להיקשר סיליקה בנוכחות מלח גבוה דרך גשר מלח. לאחר הכריכה, DNA נשטף מטומאים ונבהר בתנאי מלח נמוכים המפריעים לאינטראקציה זו.

וידאו זה עובר צעד אחר צעד, הליך כללי לחיתוך רצועה מן הג'ל, סולוביליזציה ג'ל, טיהור באמצעות כריכה לעמוד סיליקה, ו elution של DNA מטוהר. בנוסף, המצגת דנה במספר טיפים להבטחת טיהור ג'ל מוצלח, כולל החשיבות של הפעלת ג'ל אגרוז עם סמן או סולם שיש לו DNA בגדלים ידועים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טיהור ג'ל הוא הליך סטנדרטי המבוצע כדי לשחזר שברי DNA הרצויים מג'לים אגרוז לאחר הפרדה אלקטרופורטית. לאחר המסת שבר הג'ל והפעלתו דרך מסנן מיוחד, הליך זה מניב DNA משוחרר מ זיהומים כגון מלחים, נוקלאוטידים חופשיים ואנזימים, המתאימים ליישומים במורד הזרם.

העיקרון הבסיסי מאחורי שחזור DNA מג'ל אגרוז כרוך ברצף של צעדי קשירה, שטיפה ואלגנטיות. ברגע שהג'ל נמצא במאגר solubilizing, הוא מוחל על "עמוד ספין", אשר, על צנטריפוגה, מאפשר מולקולות DNA באופן סלקטיבי לאגד מסנן סיליקה בעוד זיהומים לזרום דרך לתוך צינור אוסף.

DNA הוא מסוגל להיקשר סיליקה הודות לריכוז מלח גבוה במאגר סולוביליזציה ג'ל. חיץ זה הוא האמין לשבש את מבנה הידרציה סביב המסנן וליצור גשר מלח קטיונים בין מטענים שליליים חזקים על המסנן ומטענים שליליים על ה- DNA. שאריות זיהומים מוסרים על ידי כביסה עם אתנול.

מים או מאגר מלח נמוך מתווספים לעמוד ו"יתחמקו", או ישחררו, את הדנ"א ממנו, ככל הנראה על ידי שיבוש גשר הקטיונים. הדנ"א מטוהר עכשיו מהג'ל.

השלב הראשון בהליך טיהור הג'ל כרוך בהטלת ג'ל אגרוז וביצוע אלקטרופורזה של דגימות ה- DNA. לאחר השלמת ריצת הג'ל, שברי DNA הרצויים מוצגים כנגד אור UV ורסיסים נבחרים לאחר השוואה לסטנדרט משקל מולקולרי.

אם הג'ל אינו מוכתם, מיקום הלהקה יכול להיקבע בקירב בהתבסס על השוואה לסולם ה- DNA. בעת חיתוך הג'ל עם סכין גילוח, יש להקפיד לשחזר כמה שיותר DNA עם כמה שפחות אגרוז.

בעת טיפול ג'לים מוכתמים אתידיום ברומיד ועבודה מול אור UV, כפפות ומשקפי מגן יש להשתמש. לאחר חיתוך ה- DNA הרצוי מהג'ל, יש להיפטר מהג'ל ואת מאגר הריצה כראוי, בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים.

לאחר בידוד, חתיכת הג'ל ממוקמת בצינור מיקרופוגה ומכבידה על איזון. באמצעות קירוב כי 100 מ"ג של ג'ל תופס 100 l, נפח של חוצץ solublilization כי הוא 4x משקל הג'ל מתווסף חתיכת הג'ל. לאחר שהונחה במאגר, חתיכת הג'ל היא דגירה בסביבות 50 C כדי להמיס את האגרוז.

לאחר נמס, ג'ל solubilized מתווסף על עמוד ספין ואת הפתרון הוא צנטריפוגה, אשר יגרום לכל ה- DNA וחלקיקים אחרים לדבוק המסנן.

לאחר מכן, ה- DNA הכבול נשטף על ידי הוספת 70% אתנול למסנן, ואחריו צנטריפוגה, אשר תסיר זיהומים שיורית מהמסנן. הזרימה מתבצעת, וצעד הכביסה הזה חוזר על עצמו בדרך כלל עד שלוש פעמים. המסנן הריק הוא הסתובב שוב כדי להסיר אתנול שיורית, ומסנן סיליקה מותר להתייבש בטמפרטורת החדר. מאגר מים או חצץ מתווסף למסנן, ועם סיבוב נוסף של צנטריפוגה, DNA מטוהר נאסף בתחתית הצינור.

השיטה שראית זה עתה חלה על טיהור ג'ל עם מסנני עמודות ספין סיליקה. קיימות שיטות אחרות שעושות שימוש באותם עקרונות בסיסיים של כריכת DNA לסיליקה ואחריה צעדי כביסה ואילוטציה. לדוגמה, סיליקה יכולה להיות מעורבבת עם DNA במתלה הנקראת "חלב זכוכית", אשר ניתן ללגלג ולשטוף, ומאוחר יותר לברוח. כמו כן, יניקה יכולה לשמש כדי למשוך DNA דרך מסנני סיליקה, מאוחר יותר, לחמוק ממנו. הקפד להבין את נהלי טיהור הג'ל של המעבדה שלך.

עכשיו שלמדתם איך לשחזר דנ"א מג'לים אגרוזים, בואו נבחן כמה יישומים במורד הזרם שמשתמשים בדנ"א המתקבל מטיהור ג'ל.

לדוגמה, טיהור ג'ל הוא שלב ביניים ב- Chromatin Immunoprecipitation, טכניקה שמטרתה לבודד את החלבונים הרגולטוריים הכוללים דנ"א גנומי, על מנת לזהות אילו רצפים מוסדרים. השברים המבודדים מטוהרים ומטוהרים בג'ל, על מנת להיות ממופים לאזורי הכרומוזום הבודדים.

תת-קלון - תהליך העברת גן בווקטור אחד למשנהו - יכול לכלול טיהור ג'ל. לדוגמה, רצפי גנים מווקטור אחד יכולים להתעכל ממבנה אחד, ולהרכיבם לרצפים כימריים באמצעות PCR, ולאחר מכן הם מטוהרים וג'ל ומכניסים למבנים אחרים.

אולי היישום הפשוט ביותר של טיהור ג'ל הוא השימוש בו לאחר אחסון לטווח ארוך ב -80 °C של רצועות DNA מובאות בעקבות אלקטרופורזה.

עכשיו למדת כיצד לחלץ שברי DNA מג'ל אגרוז, את הווריאציות של הליכי איגוד, לשטוף ולחמוק אחריו לפי העדפת משתמש בודדת, ולבסוף חלק מהיישומים האפשריים במורד הזרם של שיטה זו. כמו תמיד, תודה שצפית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter