Overview
겔 정제는 전기 전구 분리 후 DNA 단편을 복구하는 데 사용됩니다. 아가로즈 젤에서 DNA 회복은 실리카 컬럼에서 결합, 세척 및 용례의 세 가지 기본 단계를 포함한다. DNA는 소금 다리를 통해 높은 소금의 존재에 실리카에 결합하는 것으로 추정된다. 결합 다음, DNA는 불순물의 세척이 상호 작용을 방해 낮은 소금 조건하에서 용출된다.
이 비디오는 젤에서 밴드를 절단하기위한 단계별 일반화 절차를 거치며, 젤 용해화, 실리카 기둥에 결합을 통한 정제 및 정제 된 DNA의 용출을 통해 전달됩니다. 또한, 프리젠 테이션은 알려진 크기의 DNA가마커 또는 사다리와 아가로즈 젤을 실행하는 중요성을 포함하여 성공적인 젤 정화를 보장하기위한 몇 가지 팁을 논의한다.
Procedure
겔 정제는 전기전광 분리 후 아가로즈 겔로부터 원하는 DNA 단편을 회수하기 위해 수행된 표준 절차이다. 젤 단편을 용해하고 특수 필터를 통해 실행 한 후,이 절차는 다운스트림 응용 프로그램에 적합한 소금, 무료 뉴클레오티드 및 효소와 같은 불순물에서 해방 된 DNA를 산출합니다.
아가로즈 젤에서 DNA 복구 뒤에 기본 원리는 결합의 순서를 포함, 세척, 그리고 엘ute 단계. 젤이 용해도 버퍼에 들어가면 원심 분리시 DNA 분자가 실리카 필터에 선택적으로 결합할 수 있는 "스핀 컬럼"에 적용되어 불순물이 수집 튜브로 흘러 들어갑니다.
DNA는 젤 용해화 완충제에서 높은 염 농도 덕분에 실리카에 결합할 수 있다. 이 버퍼는 필터 주위의 수분 구조를 방해하고 필터의 강력한 음전하와 DNA에 대한 음전하 사이에 양이온 염교를 생성하는 것으로 여겨진다. 잔류 불순물은 에탄올로 세척하여 제거됩니다.
물 또는 낮은 소금 버퍼는 컬럼에 추가되고 아마도 양이온 다리를 방해하여 DNA를 "elute"또는 자유로울 것입니다. DNA는 지금 젤에서 정제됩니다.
겔 정화 절차의 첫 번째 단계는 아가로즈 젤을 주조하고 DNA 샘플의 전기 전광을 수행하는 것을 포함한다. 겔 실행이 완료되면 원하는 DNA 단편은 UV 광에 대해 시각화되고 분자량 표준과 비교한 후 단편이 선택됩니다.
겔이 스테인드가 되지 않으면, 밴드 위치는 DNA 사다리에 비해 대략 결정될 수 있다. 면도날로 젤을 자르는 동안 가능한 한 적은 아가로즈로 가능한 한 많은 DNA를 복구하는 데 주의를 기울여야합니다.
에티듐 브로마이드 스테인드 젤을 처리하고 UV 빛 앞에서 작업할 때, 장갑과 보호 안경이 사용되어야 합니다. 젤에서 원하는 DNA를 절단 한 후, 기관 안전 프로토콜에 따라 젤과 제대로 버퍼를 실행하십시오.
일단 고립되면, 젤 조각은 미세 분리 튜브에 배치하고 균형에 무게. 근사치를 이용하여 100 mg의 젤이 100l를 차지하며, 겔 중량이 4배인 솔루블화 버퍼의 부피가 젤 피스에 첨가된다. 완충제에 배치된 후, 젤 조각은 아가로즈를 녹이기 위해 약 50C에서 배양된다.
용해된 젤이 스핀 컬럼에 첨가되고 용액이 원심분리되어 모든 DNA 및 기타 미립자가 필터에 달라붙게 됩니다.
다음으로, 결합된 DNA는 필터에 70% 에탄올을 추가하여 세척되고, 원심분리가 뒤따르며, 필터에서 잔류 불순물을 제거합니다. 흐름을 통해 버려지고,이 세척 단계는 일반적으로 세 번까지 반복된다. 빈 필터는 잔류 에탄올을 제거하기 위해 다시 스펀되고 실리카 필터는 실온에서 건조할 수 있습니다. 물 또는 용출 완충액은 필터에 첨가되고, 원심분리의 또 다른 라운드와 함께, 정제 된 DNA는 튜브의 바닥에 수집된다.
방금 본 방법은 실리카 스핀 컬럼 필터로 젤 정화에 적용됩니다. 실리카에 결합하는 DNA의 동일한 기본 원리를 그 다음으로 세척 및 용출 단계를 사용하는 다른 방법이 존재합니다. 예를 들어, 실리카는 "유리우유"라고 불리는 현탁액에서 DNA와 혼합될 수 있으며, 이는 펠릿과 세척할 수 있으며 나중에 용출될 수 있다. 또한 흡입을 사용하여 실리카 필터를 통해 DNA를 끌어당기고 나중에 는 용인할 수 있습니다. 실험실의 젤 정화 절차를 이해해야 합니다.
이제 아가로즈 젤에서 DNA를 복구하는 방법을 배웠으니 겔 정화에서 얻은 DNA를 사용하는 몇 가지 다운스트림 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
예를 들어, 겔 정화는 어떤 서열이 조절되고 있는지 확인하기 위해 게놈 DNA를 묶는 규제 단백질을 분리하는 것을 목표로 하는 기술인 크로마틴 면역 침전의 중간 단계입니다. 격리된 단편은 개별 염색체 영역에 매핑되기 위해 겔 정제 및 시퀀스됩니다.
한 벡터에서 유전자를 다른 벡터로 이동하는 프로세스인 과감은 겔 정화를 수반할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 벡터로부터의 유전자 서열은 하나의 구조에서 소화되고 PCR을 통해 키메라 서열로 조립될 수 있으며, 그 후에는 겔 정제및 다른 구조로 넣을 수 있다.
아마도 겔 정화의 가장 간단한 응용 프로그램은 전기 포진 다음 절제 된 DNA 밴드의 -80 °C에서 장기 저장 후 사용이다.
이제 아가로즈 젤에서 DNA 조각을 추출하는 방법, 결합, 세척 및 엘루트 절차의 변형은 개별 사용자 선호도에 따라 이어졌으며 마지막으로이 방법의 가능한 다운스트림 응용 프로그램 중 일부를 배웠습니다. 언제나 처럼, 보고 주셔서 감사합니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
