评估药物递送系统跨细胞屏障转运的模型与方法

体内的细胞屏障在外部环境与内部腔室之间起到门户作用。例如，上皮衬层就分隔了胃肠道（GI）暴露于外界的表面与血液系统^1-3细胞屏障也构成了血液与组织和器官的实质及细胞成分之间的界面。这种情况存在于血管内的内皮衬层，例如血液-肺屏障、血脑屏障。 等等。¹穿越体内的这些细胞屏障对于将治疗和诊断试剂高效递送至需要干预的循环系统及组织/器官中至关重要。

为提高治疗剂或诊断剂的递送效率，可将这些化合物装载至亚微米级纳米载体（NCs）中。这些药物递送载体可通过多种化学成分和结构设计，以优化药物的溶解度、保护性、药代动力学、释放特性及代谢行为^4,5. 纳米颗粒也可用亲和性或靶向性基团进行功能化（例如抗体、多肽、糖类、适配体 等等。以促进其在需要治疗作用的身体部位的黏附^2,6靶向递送纳米载体至细胞屏障表面表达的特异性标志物，可进一步促进其进入和/或穿越这些屏障层^2,6.

在两个环境之间选择性转运物质的功能需要细胞层具备某些独特特征。其中一个特征是细胞极性，即面向腔隙腔面的顶膜在膜形态以及脂质、转运蛋白和受体的组成方面，与朝向组织间质的基底外侧膜存在差异²。另一个特征是连接相邻细胞的细胞间连接结构。构成紧密连接的蛋白质（特别是连接黏附分子JAMs、闭合蛋白occludins和claudins）的调控可调节屏障功能，从而选择性地允许或阻止物质在细胞间的转运，这种转运方式称为旁细胞转运，可使物质从管腔侧穿过细胞间隙进入基底外侧空间³。体内许多天然或合成成分（如白细胞、分子、颗粒及药物递送系统）与细胞屏障结合后，可能诱导细胞连接打开，这种打开可能是短暂且相对无害的，也可能是持续较久的，从而导致有害物质穿过屏障，带来安全隐患^2,5,7-9。因此，可通过测量跨上皮电阻（TEER）以及分子的被动旁细胞扩散（本文称为旁细胞泄漏）来评估该通路：电流阻力降低或惰性化合物向基底外侧空间的旁细胞泄漏增加，分别表明细胞连接的开放^5,10,11。为补充这些方法，可对上述任一紧密连接蛋白进行染色以评估其完整性，正常情况下染色应集中分布于细胞周边的细胞间连接处^5,10,12。

此外，靶向特定细胞表面决定簇的药物递送系统（例如与网格蛋白包被小窝或称为小窝蛋白的烧瓶状膜凹陷相关的决定簇）可能通过内吞作用触发细胞对囊泡的摄取，从而为药物递送至细胞内区室提供途径^5,13。此外，内吞作用可能导致囊泡在细胞内部转运，并在基底外侧释放，这一现象被称为跨细胞转运或穿胞作用¹⁴。因此，了解内吞作用的动力学和机制可用于开发细胞内和跨细胞药物递送策略，相较于旁细胞途径，该方式具有相对更高的安全性和可控性。内吞作用的机制可通过经典途径（网格蛋白介导和小窝蛋白介导的内吞作用以及巨胞饮作用）或非经典途径（如细胞黏附分子（CAM）介导的内吞作用）的调节剂进行评估^5,13,15。

虽然细胞内运输通常在标准培养皿或盖玻片上进行研究，但由于缺乏基底外侧区室，细胞无法极化，因而难以研究物质跨细胞层的转运。为克服这一障碍，长期以来研究人员利用Transwell小室系统来研究跨细胞单层的转运过程。^10,11,16,17，由上层（顶侧）室、多孔通透性膜（细胞附着其上并形成紧密单层）以及下层（基底外侧）室组成（图1在此构型中，可通过将处理物加入上室来测量从顶侧到基底侧方向的转运，处理物经细胞单层及下方的多孔膜转运后，最终收集下室中的培养基，以定量转运的物质。也可通过将处理物先加入下室，再从上室收集培养基，来测量从基底侧到顶侧方向的转运。^5,10,12,16存在多种技术可用于验证Transwell上细胞通透性屏障的形成，包括上述的TEER和细胞旁路转运实验。此外，还可将培养细胞的可渗透滤膜取出，用于成像分析例如通过荧光显微镜、共聚焦显微镜和电子显微镜等方法进一步验证细胞单层模型及其转运机制。膜类型的选择取决于多种因素，包括待转运物质或物体的大小、细胞类型和成像方法，而膜具有不同的孔径、材料和表面积可供选择。^16,18-20Transwell 小室相较于复杂的哺乳动物系统，还能实现对转运过程的可控且精确的定量分析，因为其腔室体积和细胞表面积均为已知的恒定值。尽管许多影响因素参与其中 体内 递送过程中的障碍被消除，包括肠道黏液、剪切应力、消化酶和免疫细胞的存在， 等等。，这种小规模 体外 该模型为运输过程提供了有用的初步信息。

为了说明这些方法在研究纳米载体（NC）跨细胞屏障转运中的应用^10,11,16,17，本文描述了一个示例：通过评估一种模型药物递送系统穿越人结肠直肠腺癌上皮（Caco-2）细胞单层的通透性，来模拟NC穿越胃肠道（GI）上皮的转运潜力。为此，将细胞培养于Transwell插件中的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）滤膜上，该滤膜孔径为0.8 μm，直径6.4 mm，具有透明特性，可用于显微镜成像。通过测量跨上皮电阻（TEER）、白蛋白从顶侧到基底侧的转运以及紧密连接组分闭合蛋白（occludin蛋白）的荧光显微镜观察，来验证通透性屏障的状态。本实验采用一种靶向聚合物纳米载体（NC）模型，其由100nm的不可降解聚苯乙烯纳米颗粒组成。NC通过表面吸附单独包被靶向抗体，或同时包被靶向抗体与治疗性载荷，其中任一组分均可用¹²⁵I标记以进行放射性同位素示踪。在该示例中，所用抗体识别细胞间黏附分子-1（ICAM-1），这是一种表达于胃肠道上皮细胞（及其他细胞）表面的蛋白，已被证实可促进药物载体及其载荷的细胞内和跨细胞转运²¹。载荷为α-半乳糖苷酶（α-Gal），是一种用于治疗法布里病（Fabry disease）的治疗性酶，该病是一种遗传性溶酶体贮积症²²。

将尺寸约为200nm的包被纳米颗粒（NCs）加入细胞单层上方的顶室中，在37 °C下孵育不同时间。随后可检测到NCs上的¹²⁵I与细胞单层结合和/或转运至细胞下方的基底外侧室。通过额外测定游离的¹²⁵I，可扣除降解部分，从而估算包被NCs的转运量。通过上述参数检测细胞旁通路相关的通透性屏障变化，进一步评估转运机制；而跨细胞转运则通过调节内吞和转吞途径后观察转运变化来确定。

这些方法可提供有关细胞屏障模型、药物递送系统转运程度与速率以及转运机制的重要信息，从而能够全面评估药物穿越细胞屏障递送的潜力。