Summary
Overview
Die Gelaufreinigung wird verwendet um DNA Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung zurückzugewinnen. Die DNA Rückgewinnung besteht aus 3 einfachen Schritten: dem Binden, Waschen und der Eluierung aus der Silica-Säule. Die DNA bindet das Silica durch Salzbrücken, wenn hohe Salzkonzentrationen vorhanden sind. Nach dem Binden wird die DNA gewaschen um Verunreinigungen wegzuspülen, und dann unter niedrigeren Salzbedingungen, welche die Salzbrücken unterbrechen, eluiert.
Dieses Video gibt eine Schritt für Schritt Anleitung eines allgemeinen Verfahrens, welches das Ausschneiden und die Auflösung des Gelstücks, die Aufreinigung der DNA durch deren Bindung an die Silica-Säule, und die nachfolgende Eluierung, beinhaltet. Zusätzlich dazu geben wir einige nützliche Hinweise für eine erfolgreiche Gelaufreinigung, wie zum Beispiel das Laufen des Agarose-Gels mit einem Marker oder einer DNA-Leiter, um die genaue Größe des DNA Fragments zu bestimmen.
Procedure
Die Gelaufreinigung ist ein Standardverfahren, um die gewünschten DNA Fragmente nach der elektrophoretischen Auftrennung zurückzugewinnen. Nachdem das Gelfragment aufgelöst wurde und einen speziellen Filter passiert hat, gewinnt man mit dieser Methode DNA, die ohne Verunreinigungen wie Salze, freie Nukleotiden oder Enzyme, weiterverarbeitet werden kann.
Die Grundlage hinter der Rückgewinnung von DNA aus einem Agarosegel besteht as Bindungs-, Wasch- und Eluierungsschritten. Nachdem das Gel-Fragment in einem Solubilisierungspuffer aufgelöst wurde, wird es auf eine “Zentrifugiersäule” gegeben, welche bewirkt, dass sich die DNA beim Zentrifugieren selektiv an einen Silica-Filter bindet und die Verunreinigungen in das Auffanggefäß durchfließen.
Die DNA bindet sich an das Silica wegen der hohen Salzkonzentration, die in dem Solubilisierungspuffer vorhanden ist. Dieser Puffer zerstört die Hydrationsstruktur um den Filter herum und stellt eine kationische Salzbrücke zwischen der starken negativen Ladung des Filters und der DNA her. Die übrigbleibenden Verunreinigungen werden beim Waschen mit Ethanol weggespült.
Wasser, oder Puffer mit niedriger Salzkonzentration wird dann auf die Säule gegeben, um die DNA durch die Unterbrechung der Kationenbrücken zu eluieren. Die DNA ist damit aus dem Gel aufgereinigt.
Der erste Schritt im Gelaufreinigungsverfahren ist das Herstellen eines Agarose-Gels und die elektrophoretische Auftrennung der DNA. Nachdem die DNA aufgetrennt wurde, können die gewünschten DNA Fragmente mit UV Licht abgebildet und mit Hilfe eines Molekülmassenstandards ausgewählt werden.
Wenn das Gel nicht eingefärbt wurde, kann man die ungefähre Lage der Bande durch Vergleichen mit der DNA-Leiter bestimmen. Beim Ausschneiden des Gels mit einer Rasierklinge muss man darauf achten, dass man so viel DNA und so wenig Gel wie möglich ausschneidet.
Wenn man mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen und UV Licht arbeitet, sollte man Handschuhe und eine Schutzbrille tragen. Nachdem das gewünschte DNA Fragment aus dem Gel ausgeschnitten wurde, entsorgt man das Gel und den Laufpuffer unter Einhaltung der Sicherheitsprotokolle des Instituts.
Nach der Isolation wird das Gelstück in ein Eppendorfgefäß gelegt und auf einer Waage gewogen. Mit der Annahme das 100 mg Gel gleich 100 µl Volumen sind, nimmt man das Vierfache des Gelgewichts an Solubilisierungspuffer und gibt diesen zu dem Gelstück hinzu. Nun inkubiert man das Gelstück bei ca. 50°C um die Agarose zu schmelzen.
Nachdem es geschmolzen ist, trägt man das gelöste Gel auf eine Zentrifugiersäule auf, in der die DNA und andere Partikel beim Zentrifugieren in dem Filter stecken bleiben.
Danach wird die gebundene DNA mit 70% Ethanol durch Zentrifugieren gewaschen, was die restlichen Unreinheiten aus dem Filter entfernt. Die durchgeflossene Waschlösung wird entsorgt und das Waschen wird bis zu 3 Mal wiederholt. Danach wird der leere Filter nochmals zentrifugiert um Ethanolrückstände zu entfernen. Der Silica-Filter wird dann bei Zimmertemperatur getrocknet. Danach wird Wasser oder Eluierungspuffer auf die Säule aufgetragen und zentrifugiert. Die DNA wird dadurch in dem Eppendorfgefäß gesammelt.
Die Methode, die ihr hier gerade gesehen habt, betrifft die Gelaufreinigung mit Silica-Filtern. Es gibt andere Methoden, die auf den gleichen Grundlagen der DNA Bindung an Silica, in Kombination mit Wasch und Eluierungsschritten, basieren. Zum Beispiel kann Silica mit DNA in einer Lösung die „Glasmilch“ heißt gemischt werden. Diese wird dann zu einem Pellet zentrifugiert, gewaschen und eluiert. Außerdem kann eine Saugvorrichtung genutzt werden, um die DNA durch den Filter zu ziehen. Versichert euch, dass ihr die Gelaufreinigungsverfahren, die in eurem Labor benutzt werden, versteht.
Nun das ihr gelernt habt wie man DNA aus Agarose-Gels zurückgewinnt, schauen wir uns an was man mit der DNA nach der Aufreinigung machen kann.
Zum Beispiel ist die Gelaufreinigung ein Schritt in der Chromatin Immunpräzipitation, also einer Technik mit der man Proteine isoliert, welche an genomische DNA binden, und die man verwendet, um zu sehen welche Sequenzen durch diese Proteine reguliert werden. Die isolierten Fragmente werden aufgereinigt und dann sequenziert, um sie auf einzelnen Chromosomen abzubilden.
Die Subklonierung, als der Prozess bei dem man ein Gen von einem Vektor in einen anderen kloniert, kann einen Gelaufreinigungsschritt beinhalten. Zum Beispiel kann ein Vektor verdaut werden und durch PCR in chimärische Sequenzen aneinandergefügt werden. Danach werden diese Sequenzen aufgereinigt und in andere Vektoren kloniert.
Vielleicht die einfachste Anwendung der Gelaufreinigung ist deren Verwendung nachdem die Gelstücke längerfristig bei -80˚C nach der elektrophoretischen Auftrennung gelagert wurden.
Hier habt ihr gelernt wie man DNA Fragmente von einem Agarose-Gel mit einer Kombination von Bindungs-, Wasch- und Eluierungsschritten durch dem Folgen individueller Protokolle aufreinigt. Außerdem haben wir einige Anwendungen dieser Methode erläutert. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit
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