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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Purificazione del gel

Overview

La purificazione del gel viene utilizzata per recuperare frammenti di DNA dopo la separazione elettroforetica. Il recupero del DNA da un gel di acarosio comprende tre passaggi fondamentali: legatura, lavaggio ed eluizione da una colonna di silice. Si ritiene che il DNA si leghi alla silice in presenza di sale alto attraverso un ponte di sale. Dopo il legame, il DNA viene lavato dalle impurità ed eluito in condizioni di basso contenuto di sale interrompendo questa interazione.

Questo video passa attraverso una procedura generalizzata passo-passo per tagliare una fascia dal gel, solubilizzazione del gel, purificazione attraverso il legame a una colonna di silice ed eluizione di DNA purificato. Inoltre, la presentazione discute diversi suggerimenti per garantire una purificazione del gel di successo, tra cui l'importanza di eseguire un gel di acarosio con un marcatore o una scala che ha DNA di dimensioni note.

Procedure

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La purificazione del gel è una procedura standard eseguita per recuperare i frammenti di DNA desiderati dai gel di acarosio dopo la separazione elettroforetica. Dopo aver sciolto il frammento di gel e averlo fatto passare attraverso un filtro specializzato, questa procedura produce DNA liberato da impurità come sali, nucleotidi liberi ed enzimi, adatto per applicazioni a valle.

Il principio di base alla base del recupero del DNA dal gel di acarosio comporta una sequenza di passaggi di legame, lavaggio ed eluizione. Una volta che il gel è in tampone solubilizzante, viene applicato su una "colonna di spin", che, dopo la centrifugazione, consente alle molecole di DNA di legarsi selettivamente a un filtro di silice mentre le impurità fluiscono in un tubo di raccolta.

Il DNA è in grado di legarsi alla silice grazie ad un'elevata concentrazione di sale nel tampone di solubilizzazione del gel. Si ritiene che questo tampone interrompa la struttura di idratazione attorno al filtro e crei un ponte salino cationico tra le forti cariche negative sul filtro e le cariche negative sul DNA. Le impurità residue vengono rimosse mediante lavaggio con etanolo.

L'acqua o il buffer a basso contenuto di sale viene aggiunto alla colonna e "eluisce", o libera, il DNA da essa, presumibilmente interrompendo il ponte cationico. Il DNA è ora purificato dal gel.

Il primo passo nella procedura di purificazione del gel prevede la fusione del gel di agarose e l'esecuzione dell'elettroforesi dei campioni di DNA. Una volta completato il gel-run, i frammenti di DNA desiderati vengono visualizzati contro la luce UV e i frammenti vengono selezionati dopo il confronto con uno standard di peso molecolare.

Se il gel non è macchiato, la posizione della banda può essere determinata approssimativamente in base a un confronto con la scala del DNA. Mentre si taglia il gel con una lama di rasoio, bisogna fare attenzione a recuperare più DNA possibile con il minor numero possibile di agarose.

Quando si maneggiano gel macchiati di bromuro di etidio e si lavora davanti alla luce UV, è necessario utilizzare guanti e occhiali protettivi. Dopo aver tagliato il DNA desiderato dal gel, smaltire correttamente il gel e il tampone funzionante, nel rispetto dei protocolli di sicurezza istituzionali.

Una volta isolato, il pezzo di gel viene posto in un tubo di microfuga e pesato su una bilancia. Usando l'approssimazione che 100 mg di gel occupano 100 l, un volume di tampone di soleblizzazione che è 4 volte il peso del gel viene aggiunto al pezzo di gel. Dopo essere stato posto in tampone, il pezzo di gel viene incubato a circa 50 C per sciogliere l'agarose.

Una volta fuso, il gel solubilizzato viene aggiunto su una colonna di spin e la soluzione viene centrifugata, il che farà sì che tutto il DNA e altri particolati si attacchino al filtro.

Successivamente, il DNA legato viene lavato aggiungendo il 70% di etanolo al filtro, seguito dalla centrifugazione, che rimuoverà le impurità residue dal filtro. Il flusso attraverso viene scartato e questa fase di lavaggio viene quindi generalmente ripetuta fino a tre volte. Il filtro vuoto viene nuovamente filato per rimuovere l'etanolo residuo e il filtro di silice viene lasciato asciugare a temperatura ambiente. L'acqua o il tampone di eluizione vengono aggiunti al filtro e, con un altro ciclo di centrifugazione, il DNA purificato viene raccolto sul fondo del tubo.

Il metodo che hai appena visto si applica alla purificazione del gel con filtri a colonna di rotazione della silice. Esistono altri metodi che fanno uso degli stessi principi di base del legame del DNA alla silice seguiti da fasi di lavaggio ed eluizione. Ad esempio, la silice può essere miscelata con il DNA in una sospensione chiamata "latte di vetro", che può essere pellettata e lavata e successivamente eluita. Inoltre, l'aspirazione può essere utilizzata per estrarre il DNA attraverso filtri di silice e, in seguito, eluirlo. Assicurati di comprendere le procedure di purificazione del gel del tuo laboratorio.

Ora che hai imparato come recuperare il DNA dai gel di acarosio, esaminiamo alcune applicazioni a valle che utilizzano il DNA ottenuto dalla purificazione del gel.

Ad esempio, la purificazione del gel è un passaggio intermedio nell'immunoprecipitazione della cromatina, una tecnica che mira a isolare le proteine regolatrici che raggruppano il DNA genomico, al fine di identificare quali sequenze vengono regolate. I frammenti isolati sono purificati e sequenziati in gel, per essere mappati sulle singole regioni cromosomiche.

La subclonazione - il processo di spostamento di un gene in un vettore all'altro - può comportare la purificazione del gel. Ad esempio, le sequenze geniche di un vettore possono essere digerite da un costrutto e assemblate in sequenze chimeriche tramite PCR, dopo di che vengono purificate in gel e inserite in altri costrutti.

Forse l'applicazione più semplice della purificazione del gel è il suo uso dopo la conservazione a lungo termine a -80 ° C di bande di DNA asportate dopo l'elettroforesi.

Ora hai imparato come estrarre frammenti di DNA dal gel di acarosio, le variazioni delle procedure di legame, lavaggio ed eluizione seguite secondo le preferenze individuali dell'utente e, infine, alcune delle possibili applicazioni a valle di questo metodo. Come sempre, grazie per aver guardato.

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