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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

Western Blotting é usado para identificar a presença de proteínas específicas em amostras eletroforeticamente separadas. Após a separação por uma técnica conhecida como sulfato de sódio de poliacrilamida de gel de gel eletroforese, ou SDS-PAGE, a transferência ocidental é usada para mover proteínas de um gel de poliacrilamida para um pedaço de membrana que prende as proteínas em suas respectivas localizações. Em seguida, as membranas são sondadas com anticorpos em um processo chamado imunboblotting. A imunoblotting utiliza proteína de anticorpos e anticorpos de ligação através de locais específicos de reconhecimento, fornecendo a alta especificidade necessária para identificar uma única proteína. A detecção de anticorpos ocorre utilizando sistemas de repórteres que incluem o uso de enzimas. Enzimas podem ser anexadas ao final de um anticorpo e reagir com substratos para produzir mudanças de cor ou luz. Esses sinais podem então ser imagens e quantificados usando um processo chamado densitometria.

Este vídeo-artigo apresenta uma visão geral da técnica de mancha ocidental, descrevendo a transferência ocidental, o uso de detecção de anticorpos e análise de imagem. As etapas envolvidas com a transferência ocidental, como a montagem do sanduíche de transferência e as condições de transferência, são discutidas em detalhes, bem como a teoria por trás da ligação de anticorpos e detecção desses anticorpos. As amplas aplicações dessa técnica são descritas através de vários exemplos, incluindo a detecção de interações proteína-proteína e identificação de proteínas individuais dentro de complexos proteicos.

Procedure

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Western Blotting é uma técnica poderosa utilizada por muitos pesquisadores para identificar a presença de proteínas específicas em uma amostra eleforeticamente separada usando anticorpos.

Existem 3 estágios principais desta técnica que são essenciais para um resultado de qualidade: Eletroblotting, Imunoblotting e Detecção. Antes que essas etapas sejam tentadas, o SDS-PAGE, no qual as proteínas desnaturadas são separadas por tamanho em um gel de poliacrilamida, deve ser realizada.

Eletroblotting, também é conhecida como transferência ocidental e requer um de transferência para segurar o sanduíche bem como um aparelho para transferir proteína de um gel de acrilimto para uma membrana fina. O sanduíche de eletroblotting consiste no gel e uma membrana especializada, sanduíche entre dois pedaços de papel filtro. Durante a transferência, um campo elétrico é usado, para mover as proteínas através do gel, onde ficam presas em uma membrana devido a interações carregadas e hidrofóbicas.

A imunoblotting usa anticorpos para "sondar" a membrana para proteínas específicas. Anticorpos são grandes proteínas em forma de Y que contêm dois fragmentos, também conhecidos como regiões fab, que se ligam a outras proteínas. A região da Fab define o epítope específico, ou porção específica de uma proteína, à qual um anticorpo se ligará.

Anticorpos monoclonais são anticorpos que reconhecem um único epítope e são o tipo de anticorpo preferido usado para imunoblotação devido à sua especificidade. Em contraste, os anticorpos policlonais são uma série de anticorpos diferentes que visam muitos epítopos no mesmo antígeno – ou proteína para a qual um anticorpo tem especificidade. Anticorpos monoclonais que reconhecem um epítope linear são preferidos, pois garantem que o epítope possa ser encontrado em uma proteína desnaturada, ou linearizada. Isso é importante porque muitos anticorpos só reconhecem epítopos conformais, o que significa que eles reconhecem proteínas apenas em seu estado 3D nativo.

Além dos fragmentos de Fab, os anticorpos contêm uma região de Fc, que é específica para o animal que produziu o anticorpo. Na imunoblotação, esta região é utilizada principalmente como epítope para um anticorpo secundário – um anticorpo que reconhece o primeiro anticorpo que está ligado à proteína que você está tentando detectar.

A fim de produzir um sinal observável, anticorpos são frequentemente ligados, através de sua região fc, a uma enzima repórter, como fosfattase alcalina ou peroxidase de rabanete. Essas enzimas repórteres produzem sinais reagindo com substratos para causar mudanças de cor ou produzir mudanças de luz.

Essas alterações podem então ser quantificadas usando densitometria. Densitometria é a técnica usada para medir a densidade de uma banda de proteína usando software de análise de imagem para calcular a densidade de cada banda. As bandas podem então ser diretamente quantificadas usando padrões de referência ou controladas internamente usando uma amostra de controle.

Para uma transferência ocidental bem sucedida, o gel é primeiro equilibrado em buffer de transferência por 15 minutos. A membrana também deve ser equilibrada de acordo com as instruções de fabricação.

Em seguida, o sanduíche de transferência de gel é cuidadosamente preparado no buffer de transferência para evitar que bolhas sejam presas dentro do sistema. Bolhas presas no sanduíche podem ser forçadas a sair rolando sobre elas com uma pequena pipeta. Mesmo pequenas bolhas podem interromper a transferência de proteínas causando transferência incompleta, como pode ser visto nas partes inferiores desta membrana.

Uma vez montado, o buffer de transferência adicional é derramado na câmara de transferência e é executado em 20-30 mA por 2-3 horas. O tampão de transferência contém metanol, o que aumenta a ligação das proteínas à membrana.

Uma vez que a transferência é concluída, o é desmontado e a qualidade da transferência pode ser verificada usando uma mancha proteica não específica, como Ponceau S. Isso oferece uma detecção rápida e reversível de bandas de proteínas.

O primeiro passo da imunoblotting é cobrir as demais áreas da membrana com uma solução diluída de proteínas. Esta etapa é chamada de bloqueio e é realizada, a fim de bloquear a membrana e reduzir a ligação inespecífica do anticorpo à membrana. Normalmente, a solução de bloqueio consiste em albumina de soro bovino ou leite seco não gordo dissolvido em uma solução salina tamponada. Esta etapa geralmente é feita por 1 hora para durante a noite em um shaker.

O próximo passo é incubar a membrana com o anticorpo primário diluído na solução de bloqueio. Este passo pode levar de 30 minutos para a noite e deve ser realizado com agitação suave.

Em seguida, a membrana é completamente enxaguada para reduzir a coloração de fundo não específica e o anticorpo secundário é adicionado no bloqueio do buffer à membrana. Após uma breve incubação, a membrana é novamente completamente enxaguada.

Anticorpos secundários são detectáveis graças às enzimas repórteres que estão amarradas a eles. Após a adição do substrato correto, alterações colorimétricas ou quemiluminescentes podem ser imagens e, em seguida, medidas usando técnicas de densitometria. Além disso, a escada proteica fornece uma referência de tamanho valioso para que o tamanho linear de cada proteína possa ser estimado com base no quão longe ela migrou no gel em relação aos marcadores de tamanho na escada. Observar o tamanho das proteínas detectadas através da imunoblotação é uma boa maneira de verificar se o anticorpo está reconhecendo a proteína correta e se é um monômero ou uma cópia múltipla da proteína que está sendo vista.

Existem milhares de anticorpos primários disponíveis comercialmente, o que permite a detecção e quantificação de proteínas específicas dentro de uma amostra. Aqui um pesquisador usa um anticorpo para HIF-1α para medir a quantidade desse fator de transcrição responsiva de oxigênio nas culturas celulares para testar a hipóxia. Eles também usaram um anticorpo para beta-actina para agir como um controle de carregamento. Como você pode ver, as células cultivadas em condições normais de oxigênio produziram muito menos HIF-1 do que aquelas cultivadas em baixas condições de oxigênio.

A combinação de eletroforese de gel 2D e imunoblotting pode fornecer informações valiosas sobre a presença de complexos proteicos. Aqui, as amostras foram primeiramente executadas pelo tamanho complexo proteico, e depois desnaturadas para que cada proteína individual no complexo pudesse ser separada pelo seu tamanho individual. Anticorpos para três proteínas diferentes mostram três complexos únicos contendo diferentes números dessas proteínas com cada complexo disposto em uma linha vertical. A coluna mais à esquerda contém beta-2 e MCP-21, bem como outra proteína não mostrada por esses marcadores. A coluna central mostra um complexo que continha todas as 3 proteínas, e a coluna direita continha apenas beta-2 e MCP-21.

A imunoblotação também pode ser usada para visualizar interações proteína-proteína. Isso é realizado primeiro transferindo proteínas de um gel para uma membrana de nitrocelulose e, em seguida, sondando essa membrana com proteínas adicionais. A imunoblotação é então usada para detectar se as proteínas adicionadas se complexaram com alguma das proteínas que foram imobilizadas na membrana.

Você acabou de ver o vídeo da JoVE sobre imunoblotting. Agora você deve entender como transferir proteínas para uma membrana, sondar a membrana com anticorpos e detectar o sinal. Como sempre, obrigado por assistir!

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