Summary
Overview
La transfection est la procédure d'insertion de matériel génétique, tel que l'ADN et l'ARN double brin, à l'intérieur de cellules mammifères. L'insertion d'ADN dans une cellule permet l'expression, ou la production, de protéines utilisant la propre machinerie des cellules, alors que l'insertion d'ARN dans une cellule est utilisée pour réguler vers le bas la production d'une protéine spécifique par l'arrêt de la traduction. Alors que le lieu d'action pour l'ARN transfecté est le cytoplasme, l'ADN doit être lui transporté jusqu'au noyau pour une transfection efficace. Là-bas, l'ADN peut être exprimé transitoirement pour une courte durée, ou devenir incorporé dans l'ADN génomique, où le changement est passé de cellule en cellule lors de la division.
Cette vidéo décrit les bases derrière la transfection chimique et introduit quelques uns des réactifs les plus utilisés, incluant les lipides chargés, les polymères et le phosphate de calcium. Chaque étape est décrite depuis la préparation des cellules pour la transfection jusqu'à l'analyse de l'efficacité de la transfection. De plus, la section sur les applications de cet article-vidéo décrit l'utilisation de l'électroporation et une transfection biolostique comme méthode alternative pour l'introduction d'acide nucléique dans les cellules mammifères. Elle décrit également une utilisation avancée de la transfection où la co-transfection d'ARN interférent et d'ADN sont introduits comme un moyen pour réguler vers le bas une protéine produite naturellement pendant qu'au même moment une variante mutante de celle-ci est produite à l'intérieur de la même cellule.
Procedure
La transfection est le processus d'insertion de matériel génétique, tel que l'ADN et l'ARN double brin, dans des cellules mammifères. L'insertion d'ADN autorise l'expresssion, ou production, de protéines utilisant la propre machinerie des cellules. Alors que l'insertion d'ARN double brin est utilisée pour arrêter la production d'une protéine spécifique par l'arrêt de la traduction. Cet outil puissant a permis aux chercheurs une meilleure étude des fonctions et expressions des gènes, de la fonction des protéines, et des mutations génétiques.
Il n'existe pas de réactif ou de méthode unique de transfection qui fonctionne pour tous les types de cellules. Heureusement, beaucoup de méthodes et de réactifs ont été développés dans les dernières décennies pour faciliter la transfection d'une grande variété de cellules. Ces méthodes peuvent être séparées en deux groupes principaux: les transfections chimiques et les transfections physiques.
Dans cette vidéo, nous nous concentrerons sur les différents systèmes de livraison chimique, vu qu'ils sont devenus de plus en plus communs ces dernières années. Ces méthodes incluent les approches à base de lipides, la transfection par phosphate de calcium, et l'utilisation de polymères cationiques, pour n'en nommer que quelques unes.
Les principes sous-jacents de toutes les méthodes de transfection chimique sont similaires. Ils utilisent tous des molécules porteuses chargées positivement qui complexifient avec les acides nucléiques afin de les empaqueter pour la livraison cellulaire. Ces molécules porteuses surmontent la charge négative de la barrière de la membrane cellulaire, qui les autorise à passer à travers la membrane pour délivrer leurs contenus.
Dans la transfection de lipides, les lipides cationiques forment un liposome qui se combine avec les acides nucléiques pour former un "complexe de transfection". Alors que le phosphate de calcium condense simplement l'ADN et lui donne une charge positive nette. Par ailleurs, les polymères cationiques tels que le polyéthylèneimine condense l'ADN en particules positivement chargées.
L'étape suivante dans la transfection chimique est l'attachement des complexes positivement chargés à la membrane cellulaire négativement chargée par attraction électrostatique simple.
Alors, le complexe entre dans la cellule via endocytose - un processus via lequel les molécules entrent dans la cellule grâce à des vésicules attachées à la membrane appelées endosomes.
Une fois à l'intérieur de la cellule, les acides nucléiques doivent s'échapper de l'endosome par un processus qui est encore inconnu. Une fois en dehors de l'endosome, les acides nucléiques seront dans le cytoplasme cellulaire et finalement le noyau, où la machinerie de la cellule est capable de fabriquer l'ARNm et donc les protéines à partir de celui-ci. Le cytoplasme est le lieu d'action pour le petit ARN interférent, ou ARNsi, où il réduit la production de protéines par interférence avec une partie des protéines cellulaires productrices de la machinerie
L'ADN transfecté peut exister dans un état soit stable soit transitoire. Les transfections stables apparaissent quand l'ADN transfecté est introduit dans le génome et donc persiste lorsque la cellule se divise. Les transfections transitoires apparaissent lorsque l'ADN n'est pas incorporé dans le génome et l'expression de la protéine codée est perdue après une durée de 24 à 96 heures.
L'efficacité de la transfection de l'ADN est typiquement mesurée à travers les systèmes rapporteurs qui sont attachés au gène inséré. Ceux-ci sont des systèmes qui peuvent être facilement détectés soit par observation directe de la protéine rapportrice elle-même, soit par la mesure de son activité enzymatique à l'aide d'une analyse colorimétrique, tout comme dans le cas d'une enzyme luciférase rapportrice.
Pour mesurer le succès de l'extinction de l'ARNsi, les niveaux de protéines ciblées dans chaque échantillon peuvent être déterminés par Immunoblot. La transfection réussie d'ARNsi devrait diminuer l'expression de la protéine cible à l'intérieur des cellules pendant que les niveaux de gènes domestiques, GAPDH, restent stables.
Pour maximaliser l'efficacité de la transfection, les cellules doivent être maintenues en phase de croissance et être entre 40 et 80% convergentes, au moment de la transfection. En vue d'accomplir ceci, les cellules en culture doivent être récoltées le jour avant... comptées... et ensemencées dans une plaque multi-puits à une concentration qui va donner le niveau correcte de convergence au moment de la transfection.
Ensuite, les réactifs chimiques et les acides nucléiques sont mélangés et prennent le temps de former les complexes réactifs/acides nucléiques. Pour chaque système de livraison chimique les concentrations spécifiques de chaque composé doivent être optimalisées.
Les complexes réactifs/acides nucléiques sont alors ajoutés aux cellules étalées et incubés souvent pour la nuit, afin de donner tout le temps nécessaire aux complexes pour s'attacher aux cellules et faire la transfection. Après 24 heures, le milieu doit être retiré et remplacé par un milieu de culture frais.
Il existe beaucoup de variantes et d'applications de la transfection. La co-transfection peut autoriser un chercheur à étudier l'effet des mutations faux sens sur la fonction des protéines cellulaires. Ici, l'ARNi était transfecté dans les cellules HeLa en vue de réguler à la baisse la protéine endogène BRCA1, qui cause une réduction dans le nombre de cellules GFP positives. Au même moment, une protéine mutante BRCA1 a aussi été transfectée et produite par la cellule. Si la protéine mutante était totalement fonctionnelle cela causerait une récupération dans le nombre de cellules GFP positives, mais si la mutation affecte négativement la fonction, alors le nombre de cellules GFP positives reste faible.
Comme alternative aux méthodes de transfection chimiques, un chercheur, montré ici, utilise un fusil à gène pour tirer des particules d'or attachées avec l'ADN aux cellules en culture. Les cellules qui retouvent les petites balles d'ADN enrobées à l'intérieur de leur cytoplasme ont une grande chance de devenir transfectées.
Une autre méthode alternative pour la transfection est l'électroporation. L'électroporation est l'utilisation de courant électrique pour endommager la membrane de la cellule, autorisant pour un temps court l'ADN ou l'ARN à entrer dans la cellule avant que les cellules aient le temps de réparer. Ici, les électrodes sont placées autour d'un cerveau de souris et de courtes impulsions électriques sont envoyées à travers le cerveau pour initialiser une transfection ex-vivo des molécules injectées d'ARNi à l'intérieur de la solution bleue. On peut alors observer les effets de l'extinction de gène sur la structure du cortex en développement.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la transfection. Comme toujours, merci pour votre attention!
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
