Summary
Overview
Eine Transfektion ist der Prozess durch den man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einfügt. Die Einfügung des Gens ermöglicht die Expression von Proteinen durch die zelleigene Maschinerie, wohingegen RNA in einer Zelle genutzt wird um die Expression eines Proteins durch das Hemmen der Translation zu verhindern. Die transfizierte RNA ist hauptsächlich im Zytoplasma aktiv, wohingegen die DNA für eine effiziente Transfektion in den Nukleus transportiert werden muss. Dort kann die DNA dann entweder transient (also für eine kurze Zeit) exprimiert werden, oder in die genomische DNA eingefügt werden und dadurch an Tochterzellen weitergegeben werden.
Dieses Video beschreibt die Grundlagen, die hinter der chemischen Transfektionen stehen, und behandelt einige der am häufigsten verwendeten Reagenzien, einschließlich elektrisch geladener Liposomen, Polymeren und Calcium-Phosphat. Wir beschreiben jeden Schritt wie man Zellen für eine Transfektion vorbereitet bis zu wie man die Transfektionseffizienz bestimmt. Zusätzlich beschreibt der Anwendungsteil des Videos alternative Methoden für die Transfektion, wie zum Beispiel Elektroporation und biolistische Transfektion. Es wird außerdem eine fortgeschrittenen Technik beschrieben, in der man siRNA und DNA in einen Zelle gleichzeitig einfügt, um ein zelleignes Protein zu hemmen und dann die Funktion eines mutierten Proteins zu untersuchen.
Procedure
Eine Transfektion ist der Prozess mit dem man genetisches Material, wie zum Beispiel DNA oder doppelsträngige RNA, in Säugerzellen einbringt. Diese Einbringung der DNA ermöglicht die Expression oder Produktion von Proteinen mit der zelleigenen Maschinerie der Zellen. Die Einfügung von doppelsträngiger RNA wird benutzt um die Produktion eines Proteins auszuschalten, in dem dessen Translation gehemmt wird. Dieses sehr nützliche Werkzeug erlaubt es Forschern die Funktion von Genen, Proteinen und genetischen Mutationen zu untersuchen.
Es gibt keine Transfektionsreagenz, die für alle verschiedenen Zellarten gleich gut funktioniert. Glücklicherweise wurden jedoch in den letzen Jahrzehnten Methoden und Reagenzien entwickelt um die Transfektion für viele Zelltypen zu ermöglichen. Diese Methoden können in zwei Gruppen unterteilt werden: chemische und physikalische Transfektion.
In diesem Video konzentrieren wir uns auf die verschiedenen chemischen Transfektionssysteme, da sie in den letzten Jahren immer häufiger angewendet werden. Diese Methoden schließen unter anderem Methoden die auf Liposomen basieren, Calcium-Phosphat Transfektionen und die Benutzung von kationischen Polymeren ein.
Das Grundprinzip jeder chemischen Transfektion ist ähnlich. Sie beruhen alle auf positiv geladenen Trägermolekülen, die einen Komplex mit den Nukleinsäuren bilden um sie für die Transfektion zu verpacken. Diese Trägermoleküle schaffen es die negative Ladung der Zellmembran zu überqueren, so dass sie ihren Inhalt in das Innere der Zelle bringen können.
Bei Lipofektionen formen kationische Lipide ein Liposom, das sich mit den Nukleinsäuren verbindet und so einen Transfektionskomplex bildet. Calcium-Phosphat auf der anderen Seite verdichtet nur die DNA und gibt ihr eine positive Ladung. Kationische Polymere, wie zum Beispiel Polyethelenimin, verdichten die DNA zu positiv geladenen Partikeln.
Der nächste Schritt in einer chemischen Transfektion ist die Anlagerung der positiv geladenen Komplexe an die negativ geladene Zellmembran durch einfache elektrostatische Anziehung.
Dann wird der Komplex in die Zelle durch Endozytose aufgenommen – also einem Prozess, bei dem ein Molekül in die Zelle durch ein membrangebundenes Vesikel gelangt.
Wenn sie erstmal in der Zelle sind, müssen Nukleinsäuren wieder aus den Endosomen austreten. Dieser Prozess ist bisher allerdings nicht bekannt. Wenn die Nukleinsäuren außerhalb des Endosoms sind, befinden sie sich erst im Zytoplasma der Zelle und dann im Zellkern, wo die zelleigene Maschinerie erst mRNA und dann Proteine davon herstellt. Die kleinen small interfering RNAs (siRNAs) wirken hauptsächlich im Zyotplasma in dem sie die Herstellung des Proteins durch das Hemmen der Translation verhindern.
Transfizierte DNA kann entweder stabil oder temporär in die Zelle eingebracht werden. Stabile Transfektionen treten auf wenn die DNA in das Genom der Zelle eingefügt wird und daher erhalten bleibt wenn sich die Zelle teilt. Transiente Transfektionen passieren wenn die DNA nicht in das Genom integriert wird und die Expression des Proteins daher zwischen 24-96h nachlässt.
Die Effizienz der DNA Transfektion wird normalerweise mit einem Reportersystem gemessen, das an das eingefügte Gen gekoppelt wurde. Diese Systeme können entweder einfach durch direktes Beobachten des Reporterproteins (beispielsweise des grün fluoreszierenden Proteins) erkannt werden, oder durch das Messen der enzymatischen Aktivität durch farbmetrische Verfahren, wie zum Beispiel bei Luziferase Reportern.
Um zu messen ob die siRNA erfolgreich war, kann das Expressionsniveau des Zielproteins durch Western Blot bestimmt werden. Eine erfolgreiche siRNA Transfektion verringert die Expression des Zielproteins in der Zelle, während Gene wie GAPDH (also ein Haushaltsgen) nicht betroffen sind.
Um die Transfektionseffizienz zu maximieren sollten Zellen bei der Transfektion in der logarithmischen Phase der Wachstumskurve sein, also bei einer Konfluenz zwischen 40-80%. Um das zu erreichen werden die Zellen am Tag davor geerntet, gezählt und in einer Multiwellplatte neu angesetzt. Die Konzentration wird so gewählt das die richtige Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreicht ist.
Dann werden die chemischen Reagenzien und die Nukleinsäuren vermischt damit sich die Nukleinsäure-Reagenzkomplexe bilden. Für jede chemische Methode muss die spezifische Konzentration jeder Komponente optimiert werden.
Die Nukleinsäure-Reagenzkomplexe werden dann zu den Zellen hinzugefügt und über Nacht inkubiert, damit ausreichend Zeit vorhanden ist um sich an die Zellen anlagern und die Transfektion durchzuführen. Nach 24 Stunden sollte das Medium entfernt und mit frischem Medium aufgefüllt werden.
Es gibt viele Variationen and Anwendungen der Transfektion. Eine Co-Transfektion ermöglicht es Forschern den Effekt einer Mutation für die Funktion eines Proteins zu untersuchen. Hier wurde eine RNAi in HeLa Zellen transfiziert, um das zelleigene BRCA1 Protein zu hemmen, was zu einer Verminderung der GFP positiven Zellen führt. Zur gleichen Zeit wurde ein mutiertes BRCA1 Protein in die Zelle transfiziert, welches nun von der Zelle hergestellt wird. Wenn das mutierte Protein funktionieren würde, sollte man wieder viele GFP positive Zellen sehen, wenn aber die Mutation sich negativ auf die Funktion ausübt bleibt die Zahl der GFP positiven Zellen niedrig.
Als Alternative zu chemischen Transfektionsmethoden können Forscher auch, wie hier zu sehen ist, eine biolistische Genkanone benutzen, die Goldpartikel die mit DNA bedeckt sind, auf die Zellen in Kultur schießt. Zellen mit kleinen DNA Kugeln in ihrem Zytoplasma haben eine gute Chance transfiziert zu sein.
Eine weitere alternative Methode zur Transfektion ist die Elektroporation. Bei der Elektroporation benutzt man einen elektrischen Strom, um die Zellmembran zu beschädigen und dadurch DNA und RNA in die Zelle zu lassen in der kurzen Zeit bevor die Zelle den Schaden reparieren konnte. Hier werden Elektroden in einem Maushirn platziert um kurze Pulse von Elektrizität durch das Gehirn zu leiten, damit die injizierten RNAi Moleküle in der blauen Lösung ex vivo transfiziert werden. Die Effekte des Ausschaltens eines Gens werden dann im sich entwickelnden Kortex untersucht.
Das war das Video über die Transfektion von JoVE. Wie immer- danke für eure Aufmerksamkeit.
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