Overview
טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת DNA לתא מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של התאים עצמם, ואילו החדרת RNA לתא משמשת לווסת את הייצור של חלבון מסוים על ידי הפסקת התרגום. בעוד אתר הפעולה עבור RNA transfected הוא ציטופלסמה, DNA חייב להיות מועבר לגרעין עבור transfection יעיל. שם, הדנ"א יכול להתבטא באופן ארעי לפרק זמן קצר, או להשתלב בדנ"א הגנומי, שם השינוי מועבר מתא לתא כשהוא מתחלק.
וידאו זה מתאר את היסודות מאחורי transfections כימי בתיווך ומציג כמה ריאגנטים הנפוצים ביותר, כולל שומנים טעונים, פולימרים, סידן פוספט. כל שלב מתואר מהכנת תאים לתזוזה באמצעות ניתוח של יעילות טרנספקטי. בנוסף, סעיף היישומים במאמר וידאו זה מתאר את השימוש באלקטרופורציה ובתמרה ביולית כשיטות חלופיות להכנסת חומצת גרעין לתאי יונקים. הוא גם מתאר שימוש מתקדם בטרנס-זיהום שבו שיתוף פעולה של הפרעה RNA ו- DNA מוצגים כדרך למטה-לווסת חלבון המתרחש באופן טבעי בעת ובעונה אחת לייצר גרסה מוטנטית שלו בתוך אותו תא.
Procedure
טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת דנ"א מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של התאים עצמם. בעוד החדרת RNA כפול נטוש משמשת לכיבוי הייצור של חלבון מסוים על ידי הפסקת התרגום. כלי רב עוצמה זה איפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את תפקוד הגנים ואת הביטוי, תפקוד החלבון והמוטציות הגנטיות.
אין ריאגנט או פעולת שירות יחיד של transfection פועל עבור כל סוגי התאים. למרבה המזל, שיטות רבות ריאגנטים פותחו בעשורים האחרונים כדי להקל על טרנספקטציה של מגוון רחב של תאים. ניתן להפריד שיטות אלה לשתי קבוצות עיקריות: עבירות כימיות ופיזיות.
בסרטון זה נתמקד במערכות האספקה הכימיות השונות, שכן הן הפכו שכיחות יותר ויותר בשנים האחרונות. שיטות אלה כוללות גישות מבוססות שומנים בדם, תעתיק מתווך סידן פוספט, ושימוש בפולימרים קטיקטיים אם להזכיר כמה.
העיקרון הבסיסי של כל שיטות ההדבקה הכימית דומה. כולם משתמשים במולקולות נושאות טעונות חיוביות המורכבות מחומצות גרעין כדי לארוז אותן לאספקה תאית. מולקולות נשא אלה להתגבר על המטען השלילי של מחסום קרום התא המאפשר להם לעבור דרך הממברנה כדי לספק את התוכן שלהם.
בהשתנות שומנים בדם, שומנים קטיונים יוצרים ליפוזום אשר לאחר מכן משלב עם חומצות גרעין כדי ליצור "קומפלקס transfection". בעוד סידן פוספט פשוט מחזק את ה- DNA ונותן לו מטען חיובי נטו. בנוסף, פולימרים קטיקטיים כגון פוליאתלנימין מעבים את ה- DNA לחלקיקים טעונים חיובית.
השלב הבא בתמור כימי הוא התקשרות של מתחמים טעונים חיובית לקרום התא הטעון שלילית באמצעות משיכה אלקטרוסטטית פשוטה.
לאחר מכן, המתחם נכנס לתא באמצעות אנדוציטוזיס - תהליך שבו מולקולות נכנסות לתא באמצעות שלשלות הקשורות לממברנה הנקראות אנדוזומים.
ברגע שנכנסים לתא, חומצות הגרעין חייבות לברוח מהאנדום על ידי תהליך שעדיין לא ידוע. ברגע שהם מחוץ לאנדוזום, חומצות הגרעין ימצאו את עצמן בציטופלזמה של התא ואז בסופו של דבר בגרעין, שבו המכונות של התא מסוגלות לייצר mRNA ואז חלבון ממנו. הציטופלסמה היא אתר הפעולה של הרנ"א המפריע הקטן, או siRNA שבו הוא מפחית את ייצור החלבון על ידי הפרעה לחלק ממכונות ייצור החלבון של התא.
דנ"א שהועבר יכול להתקיים ביציבות או ארעית. עבירות יציבות מתרחשות כאשר DNA שהועבר מועבר לגנום ולכן נמשך ככל שהתא מתחלק. עבירות חולפות מתרחשות כאשר ה- DNA אינו משולב בגנום והביטוי של החלבון המקודד הולך לאיבוד במהלך טווח של כ 24-96 שעות.
היעילות של טרנספקטציה DNA נמדדת בדרך כלל באמצעות מערכות עיתונאיות קשורות לגן המוחדר. אלה הן מערכות שניתן לזהות בקלות על ידי התבוננות ישירה בחלבון הכתב עצמו, כגון במקרה של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או על ידי מדידת הפעילות האנזימטית שלו באמצעות בדיקת צבע, כמו במקרה של כתב אנזים לוציפראז. תעתיק דנ"א יציב נמדד בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח גנומי כגון RT-PCR.
כדי למדוד את ההצלחה של השתקת siRNA, רמות החלבון הממוקדות בכל דגימה יכולות להיקבע על ידי אימונובלוט. טרנספקטציה מוצלחת של siRNA אמורה להקטין את הביטוי של חלבון היעד בתוך התאים בעוד שרמות הגן של משק הבית, GAPDH, נשארות יציבות.
כדי למקסם את יעילות ההדבקה, תאים צריכים להישמר בצמיחת שלב היומן ולהיות בין 40 ל -80% מפגש, בזמן ההדבקה. על מנת להשיג זאת, תאים בתרבית צריכים להיות נקצרים יום קודם לכן... נספר... וזרע לתוך צלחת רבת באר בריכוז שיניב את הרמה הנכונה של מפגש בזמן transfection.
לאחר מכן, ריאגנטים כימיים וחומצות גרעין מעורבבים וניתן זמן כדי ליצור את קומפלקסים חומצה-ריאגנט גרעין. עבור כל מערכת משלוח כימית הריכוזים הספציפיים של כל רכיב חייבים להיות ממוטבים.
מתחמי חומצת גרעין ריאגנט מתווספים לאחר מכן לתאים מצופים ודגר לעתים קרובות בן לילה כדי לתת שפע של זמן עבור המתחמים להתחבר לתאים ולתווך transfection. לאחר 24 שעות, יש להסיר את המדיה ולהחליף אותה במדיה תרבותית טרייה.
קיימים וריאציות ויישומים רבים של טרנספקטציה. שיתוף פעולה יכול לאפשר לחוקר לחקור את ההשפעה של מוטציות missense על הפונקציה של חלבונים תאיים. כאן, RNAi היה transfected לתוך תאי HeLa על מנת למטה-לווסת את חלבון BRCA1 אנדוגני, אשר גורם לירידה במספר תאים חיוביים GFP. באותו זמן חלבון BRCA1 מוטציה גם הועבר והופק על ידי התא. אם החלבון שעבר מוטציה היה פונקציונלי לחלוטין זה גרם להתאוששות במספר התאים החיוביים GFP, אבל אם המוטציה השפיעה לרעה על התפקוד, אז מספר התאים החיוביים GFP נשאר נמוך.
כחלופה לשיטות טרנספקטציה כימיות, חוקר, המוצג כאן, משתמש באקדח גנים כדי לירות חלקיקי זהב מעורבבים עם DNA בתאים בתרבית. לתאים שמסתיימת עם הכדורים הקטנים מצופים הדנ"א בתוך הציטופלסמה שלהם יש סיכוי טוב להיות מודבקים.
שיטה חלופית נוספת לתמרה היא אלקטרופורציה. אלקטרופורציה היא שימוש בזרם חשמלי כדי לפגוע בקרום התא ומאפשר לדנ"א או לרנ"א להיכנס לתא לזמן קצר לפני שלתאים יהיה זמן לתקן. כאן, אלקטרודות פינצטה ממוקמות סביב מוח עכבר ופולסים קצרים של חשמל מועברים דרך המוח כדי ליזום transfection ex-vivo של מולקולות RNAi מוזרק בתוך הפתרון הכחול. ההשפעות של השתקת גנים על המבנה של קליפת המוח המתפתחת הוא ציין לאחר מכן.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על טרנספקטציה. כמו תמיד, תודה שצפית!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
