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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

형질전환은 DNA 및 이중 좌초 RNA와 같은 유전 물질을 포유류 세포에 삽입하는 과정입니다. 세포내 DNA를 삽입하면 세포소유의 기계를 사용하는 단백질의 발현 또는 생산이 가능하지만, RNA를 세포로 삽입하는 것은 번역을 중단함으로써 특정 단백질의 생산을 다운조절하는 데 사용된다. 트랜스페드 RNA를 위한 작용의 사이트는 세포질인 동안, DNA는 효과적인 transfection를 위해 핵으로 수송되어야 합니다. 그곳에서 DNA는 단기간 동안 일시적으로 발현되거나, 갈라질 때 세포에서 세포로 전환되는 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

이 비디오는 화학 매개 트랜스페션의 기본을 설명하고 충전된 지질, 폴리머 및 칼슘 인산염을 포함하여 가장 일반적으로 사용되는 시약의 일부를 소개합니다. 각 단계는 경질 효율의 분석을 통해 형질 전달을 위한 세포의 준비에서 기술됩니다. 추가적으로, 이 비디오 기사의 응용 단면도는 포유류 세포로 핵산을 소개하기 위한 대체 방법으로 전기기와 생물권 형 형 질의 사용을 설명합니다. 또한 간섭 RNA와 DNA의 동시 형질이 자연발생 단백질을 다운 조절하는 동시에 동일한 세포 내에서 돌연변이 변이체를 생성하는 방법으로 도입되는 트랜스페션의 고급 사용을 설명합니다.

Procedure

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형질전환은 DNA 및 이중 좌초 RNA와 같은 유전 물질을 포유류 세포에 삽입하는 과정입니다. DNA의 삽입은 세포가 기계류를 소유하는 단백질의 발현 또는 생산을 가능하게 합니다. 이중 좌초 RNA의 삽입은 번역을 중지하여 특정 단백질의 생산을 종료하는 데 사용되는 반면. 이 강력한 도구는 연구원이 유전자 기능 및 발현, 단백질 기능 및 유전 적 돌연변이를 더 잘 연구 할 수있게했습니다.

단일 형질 전환 시약이나 방법은 모든 셀 유형에 대해 작동하지 않습니다. 다행히도, 많은 방법과 시약은 세포의 다양한 의 전형을 용이하게하기 위해 지난 수십 년 동안 개발되었습니다. 이러한 방법은 화학 적 및 물리적 인 트랜스펙트라는 두 가지 주요 그룹으로 분리 될 수 있습니다.

이 비디오에서는 최근 몇 년 동안 점점 더 보편화됨에 따라 다양한 화학 물질 전달 시스템에 초점을 맞출 것입니다. 이러한 방법에는 지질 기반 접근법, 칼슘 인산염 매개 형 형 질염, 그리고 몇 가지 이름을 가온성 폴리머의 사용이 포함합니다.

모든 화학 적 전환 방법의 기본 원리는 유사합니다. 그(것)들은 모두 세포 전달을 위해 그(것)들을 포장하기 위하여 핵산으로 복잡한 긍정적으로 충전된 담체 분자를 이용합니다. 이 운반대 분자는 그(것)들이 그들의 내용을 전달하기 위하여 막을 통과할 수 있는 세포 막 장벽의 음성 전하를 극복합니다.

지질 성 전환에서, 양이온 지질은 다음 "트랜스프ction 복합체"를 형성하기 위해 핵산과 결합 하는 지질을 형성. 칼슘 인산염은 단순히 DNA를 응축하고 순 양성 전하를 주는 반면. 또한, 폴레헬레네이민과 같은 양이온 성 폴리머는 DNA를 양전하 입자로 응축한다.

화학 매개 형질의 다음 단계는 간단한 정전기 매력을 통해 음전하 세포막에 양하하 복합체의 부착입니다.

그런 다음, 복합체는 내분비증을 통해 세포에 진입합니다 - 분자가 내분이라고 불리는 막 바인딩 소포를 통해 세포로 들어가는 과정.

일단 세포 안쪽에, 핵산은 아직도 알려지지 않은 프로세스에 의해 내성에서 탈출해야 합니다. 일단 내분비 밖으로, 핵산은 세포의 세포질에서 그 후에 궁극적으로 세포의 기계가 mRNA를 만들고 그 것에서 단백질을 만들 수 있는 핵에 있는 자신을 찾아낼 것입니다. 세포질은 세포의 단백질 생산 기계의 일부를 방해하여 단백질의 생산을 감소시키는 작은 간섭 RNA, 또는 siRNA를 위한 작용의 사이트입니다.

감염된 DNA는 안정적으로 또는 일시적으로 존재할 수 있습니다. 안정된 전환은 전염된 DNA가 게놈으로 소개될 때 생기고, 따라서 세포가 분할할 때 지속됩니다. 과도 성 과속은 DNA가 게놈에 통합되지 않고 코딩 된 단백질의 발현이 약 24-96 시간의 기간 동안 손실되는 곳에서 발생합니다.

DNA 이식의 효율은 전형적으로 삽입된 유전자에 묶여 있는 리포터 시스템을 통해 측정됩니다. 이들은 녹색 형광 단백질의 경우와 같이 기자 단백질 자체를 직접 관찰하거나, 루시파라제 효소 리포터의 경우와 같이 색소측정 분석을 사용하여 효소 활성을 측정함으로써 쉽게 검출할 수 있는 시스템입니다. 안정적인 DNA 형질전환은 RT-PCR와 같은 유전체 분석에 의해 가장 잘 측정된다.

siRNA 침묵의 성공을 측정하기 위해 각 샘플의 표적 단백질 수준은 면역블롯에 의해 결정될 수 있습니다. 성공적인 siRNA 형질은 가사 유전자, GAPDH의 수준이 안정적으로 유지되는 동안 세포 내의 표적 단백질의 발현을 감소시켜야한다.

전환 효율을 최대화하려면 세포는 로그 상 성장에서 유지되어야 하며, 전환 시 40~80% 컨할 수 있어야 합니다. 이를 달성하기 위해 문화 세포는 전날 수확해야합니다 ... 계산... 및 배분 시 정확한 수준의 인플루엔자를 산출하는 농도에서 다중 우물 플레이트로 시드됩니다.

다음으로, 화학 시약 및 핵산은 혼합되어 핵산 시약 복합체를 형성하는 데 시간이 주어집니다. 각 화학 전달 시스템에 대해 각 성분의 특정 농도를 최적화해야 합니다.

핵산 시약 복합체는 도금 된 세포에 첨가되고 복합체가 세포에 부착하고 형체를 중재 할 수있는 충분한 시간을 주기 위해 하룻밤 동안 자주 배양됩니다. 24시간 후에는 미디어를 제거하고 신선한 문화 매체로 대체해야 합니다.

많은 변형및 형질 전환의 응용 프로그램이 존재합니다. 공동 형질은 연구원이 세포 단백질의 기능에 잘못된 감각 돌연변이의 효력을 연구하는 것을 허용할 수 있습니다. 여기서, RNAi는 GFP 양성 세포의 수에 있는 감소를 일으키는 원인이 되는 내인성 BRCA1 단백질을 다운 조절하기 위하여 HeLa 세포로 전감염되었다. 동시에 돌연변이 BRCA1 단백질은 세포에 의해 전과감염되고 생산되었다. 돌연변이 된 단백질이 완전히 기능적이라면 GFP 양성 세포의 수에서 회복을 일으켰지만 돌연변이가 기능에 부정적인 영향을 미치는 경우 GFP 양성 세포의 수는 낮게 유지되었습니다.

화학 적 이식 방법에 대한 대안으로, 여기에 표시된 연구원은 문화 에서 세포에서 DNA로 묶인 금 입자를 발사하기 위해 유전자 총을 사용합니다. 세포질 내의 작은 DNA 코팅 탄환으로 끝나는 세포는 전감염되기위한 좋은 기회가있다.

경질에 대한 또 다른 다른 방법은 전기 기화입니다. 전기기는 DNA 또는 RNA가 세포가 복구할 시간이 있기 전에 짧은 시간 동안 세포에 들어갈 수 있도록 세포의 막을 손상시키기 위해 전류를 사용하는 것이다. 여기서, 트위저 전극은 마우스 뇌 주위에 배치되고 짧은 전력 펄스는 뇌를 통과하여 청액 내에서 주입된 RNAi 분자의 전 생체 변환을 개시한다. 개발 피질의 구조에 유전자 침묵의 효력은 그 때 관찰됩니다.

당신은 방금 트랜스페이션에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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