Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

Reazioni di legatura del DNA

Overview

In biologia molecolare, la legatura si riferisce all'unione di due frammenti di DNA attraverso la formazione di un legame fosfodiestere. Un enzima noto come ligasi catalizza la reazione di legatura. Nella cellula, le ligases riparano le rotture a singolo e doppio filamento che si verificano durante la replicazione del DNA. In laboratorio, la DNA ligasi viene utilizzata durante la clonazione molecolare per unire frammenti di DNA di inserti con vettori - molecole di DNA portatrici che replicheranno frammenti bersaglio negli organismi ospiti.

Questo video fornisce un'introduzione alla legatura del DNA. Viene descritto il principio di base della legatura e una procedura passo-passo per impostare una reazione di legatura generalizzata. Vengono discussi gli aspetti critici delle reazioni di legatura, come il modo in cui la lunghezza di una sporgenza appiccicosa dell'estremità influisce sulla temperatura di reazione e come il rapporto tra l'inserto del DNA e il vettore dovrebbe essere adattato per prevenire l'auto-legatura. Vengono menzionati strumenti molecolari che aiutano con legazioni come il frammento di Klenow e la fosfatasi alcalina di gamberetti (SAP) e vengono presentate anche applicazioni , come legature di prossimità e l'aggiunta di linker ai frammenti per il sequenziamento.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La legatura può essere definita come l'atto di unire, e in biologia il termine si riferisce a una reazione enzimatica che unisce due biomolecole con un legame covalente. Questo video descrive l'applicazione della legatura del DNA nella ricerca di biologia molecolare.

Nella cellula, le gas di DNA sono enzimi che identificano e sigillano le rotture nel DNA catalizzando la formazione di legami fosfodiestere tra i gruppi 3'-idrossile e 5'-fosfato della spina dorsale del DNA. La legatura avviene come parte dei normali processi cellulari, come la replicazione del DNA, per riparare le rotture del DNA a singolo e doppio filamento.

In laboratorio, le ligases del DNA vengono abitualmente utilizzate nella clonazione molecolare - un processo che unisce frammenti di DNA digeriti dall'endonucleasi, o inserti, con un vettore digerito dall'endonucleasi, come un plasmide, in modo che il frammento possa essere introdotto nelle cellule ospiti e quindi replicato.

Le digestioni dell'endonucleasi comportano l'uso di endonucleasi di restrizione, o enzimi di restrizione, che creano nick a specifici tratti di DNA.

Questi nick possono assomigliare a rotture a singolo filamento che producono sporgenze da 3 'e 5', chiamate estremità appiccicose o rotture a doppio filo senza sporgenze, chiamate blunt-ends. Legare le estremità appiccicose è vantaggioso, perché le coppie di basi sporgenti complementari stabilizzano la reazione. Poiché le legature terminali smussate non hanno alcun accoppiamento di basi complementare, la legatura è meno efficiente e più difficile per l'enzima unirsi alle estremità. Le estremità appiccicose e smussate non possono, in circostanze normali, essere legate insieme.

Tuttavia, il frammento di Klenow, il prodotto della DNA polimerasi 1, digerito con subtilitina può convertire le estremità appiccicose in estremità smussate. Klenow possiede un'attività di esonucleasi da 3' a 5' che mastica sporgenze di 3' e attività polimerasi che smussa le sporgenze di 5' estendendo l'estremità 3' del filamento complementare.

Quando l'obiettivo è quello di inserire un gene in un plasmide, la risigillatura del DNA vettoriale, chiamata auto-legatura, è un risultato indesiderato comune per una reazione di legatura. Il trattamento con fosfatasi alcalina del DNA vettore post-digestione rimuove i 5'fosfati su entrambe le estremità e previene questo risultato indesiderato.

Come accennato in precedenza, i DNA vettoriali e inserti vengono digeriti con endonucleasi prima di iniziare una legatura. Dopo la purificazione su gel del vettore digerito e dell'inserto, le concentrazioni di DNA vengono misurate con uno spettrofotometro per determinare la concentrazione del vettore purificato e dell'inserto.

Da questa concentrazione, il numero di molecole di inserto o vettore in 1 μl può essere determinato in base al peso molecolare medio per una coppia di basi di DNA e al numero di coppie di basi in ciascun frammento. Sulla base della concentrazione molecolare calcolata di vettore e inserto, viene calcolato un rapporto 3 a 1 tra inserto e vettore, per determinare il volume del vettore e dell'inserto utilizzato nella reazione. Questo rapporto 3 a 1 tra l'inserto del DNA e il vettore è auspicabile, perché aumenta la probabilità che l'inserto venga legato in vettore rispetto al vettore che si lega.

Ora che abbiamo determinato la quantità di vettore e inserito il DNA da utilizzare nella reazione, procediamo a impostare la reazione di legatura sul ghiaccio. L'ordine di aggiunta in cui i componenti di reazione devono essere aggiunti al tubo del microfugo è il seguente: acqua sterile sufficiente per un volume finale di 10 μl, nel nostro caso useremo 4 μl, 1 μl 10X di tampone di legatura, 1 μl 10mM di ATP, 1 μl di dna vettoriale e 3 μl di inserto, come calcolato, e infine 1 μl dna ligasi. La reazione viene miscelata accuratamente, centrifugata e incubata alla temperatura appropriata.

Sia che tu stia facendo una legatura appiccicosa o smussata influisce sulla temperatura e sulla durata della reazione di legatura. Ad esempio, una legatura dell'estremità appiccicosa con una sporgenza a sei coppie di basi può essere eseguita vicino alla temperatura ambiente per circa 1 ora, perché le estremità complementari stabilizzano l'unione dei frammenti. Sporgenze corte o legature terminali smussate devono essere eseguite tra 14-20°C durante la notte.

Ora che abbiamo imparato come impostare una reazione di legatura, diamo un'occhiata ad alcune delle applicazioni di questa procedura.

Le legature possono essere utilizzate per inserire direttamente frammenti amplificati dalla PCR in plasmidi linearizzati. Qui si vede un ricercatore che prende un campione di cervello di topo congelato, isolando il DNA genomico da esso, e poi sottoponendolo a bisolfito PCR, che è un metodo basato sulla PCR per rilevare il DNA metilato. I prodotti PCR vengono quindi legati direttamente nel plasmide per creare una libreria di geni che sono metilati in quella particolare regione del cervello.

Le legature possono essere utilizzate per attaccare i linker oligonucleotidici, che contengono siti di legame per i primer PCR, per purificare i frammenti di DNA. Quando si lavora con campioni di tumore, gli scienziati possono utilizzare questo approccio per sequenziare il DNA genomico del tumore, con la speranza di identificare le mutazioni che causano il tumore.

In questo video, la legatura viene eseguita su DNA isolato da cellule fisse di formaldeide e successivamente trattato con un enzima di restrizione e klenow in presenza di biotina, che viene poi utilizzato per abbattere il DNA legato. Questo DNA viene quindi amplificato utilizzando la PCR e i prodotti sequenziati per identificare le interazioni cromatiche a varie scale come mostrato.

Ora hai imparato a conoscere la DNA ligasi, vari principi coinvolti nella creazione della legatura in laboratorio, potenziali problemi e correzioni e varie applicazioni della legatura nella ricerca di biologia molecolare. Grazie per l'attenzione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Waiting X
Simple Hit Counter