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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

분자 생물학에서, 결찰은 인포디스터 결합의 형성을 통해 2개의 DNA 단편의 결합을 말합니다. 리구아제로 알려진 효소는 결찰 반응을 촉매한다. 세포에서, 리갈은 DNA 복제 도중 생기는 단 하나 및 이중 가닥 나누기를 복구합니다. 실험실에서 DNA 리구슬은 분자 복제 중에 벡터와 삽입의 DNA 단편을 결합하는 데 사용됩니다 - 숙주 유기체에서 표적 단편을 복제할 담체 DNA 분자.

이 비디오는 DNA 결찰에 대한 소개를 제공합니다. 결찰의 기본 원리는 일반화된 결찰 반응을 설정하기 위한 단계별 절차뿐만 아니라 설명된다. 결찰 반응의 중요한 양상은 끈적끈적한 말돌출의 길이가 반응 온도에 어떻게 영향을 미치는지, DNA 삽입의 비율이 벡터에 대한 비율을 어떻게 조정해야 하는지와 같이 논의된다. 클레나우 단편 및 새우 알칼리인스파타제(SAP)와 같은 결찰을 지원하는 분자 도구가 언급되고, 근접 결찰 및 시퀀싱을 위한 조각에 링커를 추가하는 등의 응용 분야도 제시된다.

Procedure

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결찰은 결합의 행위로 정의될 수 있고, 생물학에서 용어는 동월결합을 가진 2개의 생체 분자를 결합하는 효소 반응을 말합니다. 이 비디오는 분자 생물학 연구에서 DNA 결찰의 적용을 설명합니다.

세포에서 DNA 리거는 DNA 백본의 3'-하이드록실과 5'인산염 그룹 사이의 인포디스터 결합의 형성을 촉매하여 DNA에서 휴식부분을 식별하고 밀봉하는 효소입니다. 결찰은 DNA 복제와 같은 정상적인 세포 과정의 일부로 발생하며 단일 및 이중 가닥 DNA 파손을 복구합니다.

실험실에서 DNA 리구지는 분자 복제에 일상적으로 사용됩니다 - 플라스미드와 같은 엔도뇌리스 소화 벡터를 결합하는 과정인 것으로, 그 다음 복제할 수 있습니다.

엔도누클리스 소화는 제한 엔도누블레스의 사용을 포함, 또는 제한 효소, DNA의 특정 뻗어에서 닉을 만드는.

이 닉은 3'와 5'오버행을 생산하는 단일 가닥 휴식과 유사할 수 있으며, 끈적끈적한 끝 또는 무딘 끝이라고 불리는 오버행이없는 이중 가닥 휴식이라고합니다. 끈적끈적한 끝을 리깅하는 것은 유리하게 돌출된 베이스 쌍이 반응을 안정화시키기 때문에 유리합니다. 무딘 끝 결찰에는 무료 베이스 페어링이 없기 때문에 효소가 끝에 합류하기가 덜 효율적이고 더 어렵습니다. 끈적끈적하고 무딘 끝은 정상적인 상황에서 함께 결찰 될 수 없습니다.

그러나, 클레나우 단편, DNA 폴리머라제 1의 제품, 서브틸리신으로 소화되면 끈적끈적한 끝을 무딘 끝으로 변환할 수 있다. Klenow는 3'에서 5'exonuclease 활성을 가지고 있어 보완 가닥의 3'끝을 연장하여 5오버행을 무디게 하는 3'오버행 및 중합활성을 감취합니다.

목표는 플라스미드에 유전자를 삽입하는 것입니다 때, 자기 결찰이라고 칭식에게 불린 벡터 DNA의 재밀봉은, 결찰 반응을 위한 일반적인 바람직하지 않은 결과입니다. 벡터 DNA 후 소화의 알칼리성 인산염 치료는 양쪽 끝에 5'인산염을 제거하고이 바람직하지 않은 결과를 방지합니다.

앞서 언급했듯이 벡터 및 삽입 DN은 결찰을 시작하기 전에 엔도니션으로 소화됩니다. 소화벡터의 겔정화에 이어, DNA 농도는 정제된 벡터의 농도를 결정하기 위해 분광계계를 측정하고 삽입한다.

이러한 농도로부터, 1 μl내의 삽입 또는 벡터의 분자 수는 DNA 염기 쌍및 각 단편의 염기 쌍의 수에 대한 평균 분자량에 기초하여 결정될 수 있다. 벡터 및 인서서드의 계산된 분자 농도에 기초하여, 벡터에 대한 삽입의 3 대 1 비율이 계산되고, 반응에 사용되는 벡터의 부피를 결정하고 삽입한다. 벡터에 대한 DNA 삽입의 이 3 대 1 비율은 벡터 리그링 자체대 벡터로 계각되는 삽입의 확률을 ups때문에 바람직하다.

이제 우리는 반응에 사용하기 위해 벡터의 양을 결정하고 DNA를 삽입, 우리는 얼음에 결찰 반응을 설정하는 진행. 반응 성분을 마이크로퍼지 튜브에 추가해야 하는 추가 순서는 다음과 같습니다: 10 μl 최종 부피를 만들기에 충분한 멸균 수, 우리의 경우 우리는 4 μl, 1 μl 10X 의 결찰 버퍼, ATP의 1 μl 10mM, 벡터 1 μl 및 3 μl 삽입 DNA를 사용합니다. , 계산된 바와 같이, 마지막으로 1 μl DNA 리개세. 반응은 철저하게 혼합, 원심 분리 및 적절한 온도에서 인큐베이션.

끈적거리거나 무딘 결단 결찰을 수행하든 결찰 반응의 온도와 지속 시간에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 6개의 베이스 쌍 오버행을 가진 끈적끈적한 끝 결찰은 상온 근처에서 약 1시간 동안 수행될 수 있으며, 이는 상호 보완적인 끝이 조각의 결합을 안정화시키기 때문이다. 짧은 오버행 또는 무딘 끝 결찰은 하룻밤 사이에 14-20°C 사이에 수행되어야 합니다.

이제 리그레이션 반응을 설정하는 방법을 배웠으니 이 절차의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

결찰은 PCR 증폭 된 조각을 선형화된 플라스미드에 직접 삽입하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 연구원이 얼어 붙은 마우스 뇌 샘플을 채취하고, 유전체 DNA를 분리한 다음, 메틸화 된 DNA를 검출하는 PCR 기반 의 방법인 비황피티 PCR에 복종하는 연구원을 볼 수 있습니다. PCR 제품은 그 때 그 특정 두뇌 지구에 메틸화되는 유전자의 라이브러리를 만들기 위하여 플라스미드로 직접 계합됩니다.

결찰은 DNA 단편을 정화하기 위해 PCR 프라이머에 대한 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 링커를 부착하는 데 사용할 수 있습니다. 종양 견본으로 일할 때, 과학자는 종양 일으키는 돌연변이를 확인하는 희망으로 종양 게놈 DNA를 순서화하기 위하여 이 접근을 이용할 수 있습니다.

이 비디오에서, 결찰은 포름알데히드 고정 세포로부터 분리된 DNA에 수행되고 그 후에 계산된 DNA를 아래로 당기기 위하여 이용되는 비오틴의 존재에 있는 제한 효소 및 klenow로 취급됩니다. 이 DNA는 그 때 PCR를 사용하여 증폭되고 표시된 것과 같이 각종 비늘에서 크로마틴 상호 작용을 확인하기 위하여 순서화된 제품.

당신은 지금 DNA ligase, 실험실에 있는 결찰을 설치에 관련되었던 각종 원리, 잠재적인 문제 및 수정 및 분자 생물학 연구에서 결찰의 각종 응용에 관하여 배웠습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Disclosures

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