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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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제한 효소 분해

Overview

제한 효소 또는 엔도누리스는 특정 서열에서 DNA를 인식하고 절단합니다. 이 효소는 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지에 대한 방어로 박테리아에서 자연적으로 발생합니다. 세균 제한 효소는 메틸 그룹의 첨가로 인해 세균성 게놈 DNA를 손상시키지 않고 침입하는 박테리오파지 DNA를 절단합니다.

이 비디오는 제한 효소의 명명 방법과 인식 사이트 및 존재하는 오버행의 유형을 포함하여 제한 효소의 기본 원리를 설명합니다. 또한 필요한 구성 요소, 혼합물을 조립해야 하는 순서 및 전형적인 배양 온도 및 시간을 포함하여 제한 다이제스트를 설정하는 방법에 대한 단계별 일반화 절차가 제공됩니다. 스타 활성을 방지하기 위해 제한 효소를 비활성화하는 것이 중요하다는 것이 언급된다. 소화 반응에 있는 다중 효소를 능력을 발휘하고 대조군을 사용하기 위한 팁도 제공됩니다.

Procedure

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제한 효소, 또는 제한 엔토나크리스는 분자 생물학에서 다양한 응용 분야에서 사용됩니다. 이 효소는 제한 부위에게 불린 특정 DNA 순서를 인식하고 갈라둡니다. 당신이 보고하려고하는 비디오는 기적적인 분자에 대한 몇 가지 배경 정보를 제공하고 제한 효소 다이제스트를 설정하는 방법을 보여줍니다.

제한 효소는 어쨌든 어디에서 오는가? 이 효소는 박테리오파지로 알려져 있는 바이러스에 대하여 방어 기계장치로 작용하는 박테리아의 적응일 일이 일어납니다. 세균 DNA에 효소 사이트를 제한하는 메틸 그룹의 추가 덕분에, 제한 효소는 파지 DNA를 인식하고 잘라, 따라서 감염을 방지.

제한 효소는 꽤 이상한 이름을 가지고 있습니다. 예를 들어, 힌드III, NotI, 에코리 및 밤히. 제한 효소 이름의 처음 세 글자들은 분리된 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 제한 효소 EcoRI는 대장균으로부터 분리되었다. 네 번째 문자는 필요한 경우 효소가 분리된 세균균을 말합니다. 로마 숫자는 그 특정 유기체에서 분리된 첫번째, 두 번째, 세 번째, 효소인지 를 나타냅니다.

제한 효소는 인식 부위라고 불리는 4~8개의 염기 쌍인 뉴클레오티드의 서열을 인식합니다. 서열 내의 특정 뉴클레오티드에서 효소는 DNA 백본에서 인포디스터 결합을 깨뜨릴 것이다. 인식 사이트는 일반적으로 palindromic, 시퀀스가 동일한 앞뒤로 읽는 것을 의미합니다. 팔린드롬은 DNA 분자의 보완 가닥에서 발견될 때 반전 된 반복 팔린드롬이라고합니다.

제한 효소는 DNA가 갈라지면 다른 유형의 끝을 남길 수 있습니다: 끈적끈적한 끝과 무딘 끝. 끈적끈적한 끝은 3'와 5'오버행을 남기고 무딘 끝은 오버행을 남기지 않습니다. 끝의 모형은 제한 효소 다이제스트에 의해 단개된 DNA 단편이 결찰으로 알려져 있는 프로세스에 있는 그밖 DNA 단편과 어떻게 재결합될 지 지시합니다.

제한 효소 다이제스트는 신중하게 계획되어야 합니다. 소화 반응은 전형적으로 다음과 같은 것으로 구성됩니다: 탈이온화된 물, 절단될 DNA, 당신이 사용할 효소에 특이적인 완충제, 그리고 때때로 소 혈청 알부민 또는 BSA에게 불린 단백질. BSA는 다이제스트를 수용하는 용기의 측면에 효소가 달라붙지 않도록 하여 반응을 안정화시킬 것이다. 각 제한 효소는 잠재적으로 BSA에 대한 다른 완충 조건, 인큐베이션 온도 및 요구 사항을 가질 수 있습니다. 제한 효소 공급업체는 필요한 모든 정보를 얻기 위해 확인할 수 있는 리소스를 갖게 됩니다.

다이제스트 를 설정하려면 냉동고 나 냉장고에서 제한 효소를 검색하십시오. 얼음 또는 열 저항 용기에 제한 효소를 유지하여 향후 반응에 최적의 활성이 있는지 확인하십시오. 마이크로퍼지 튜브 반응 성분에 다음 순서로 추가되어야 한다. 첫째, 20μL의 최종 반응 부피를 산출하는 멸균, 핵자유수의 부피. 그런 다음 10x 제한 효소 버퍼, 필요한 경우 BSA, DNA의 최대 1μg, 효소 2-10 단위. 단위는 50μL 반응 부피에서 37°C에서 60분 안에 1μg의 대조군 DNA를 완전히 소화하는 데 필요한 효소의 양으로 정의됩니다. 후, 튜브의 바닥에 있는 내용을 수집하기 위하여 마이크로 원심분리기에 12,000xg에서 잠시 소용돌이 및 원심분리기를 섞는다. 그런 다음 제한 효소에 대한 최적의 온도에서 배양, 일반적으로 1 ~ 4 시간 동안 가열 블록에서 37 °C.

소화가 완료되면 반응 혼합물을 65°C에서 배양하여 제한 효소를 가열하는 것이 좋습니다. 제한 효소는 사이트 특히 대부분의 시간을 잘라 하는 동안, 장기간 된 잠복 기 별 활동으로 이어질 수 있습니다., 비슷한 사이트에서 절단, 하지만 그들의 전형적인 소화 사이트와 구별.

불활성화에 따라, DNA는 소화가 성공적이었다는 것을 확인하기 위하여 아가로즈 젤에서 실행되어야 합니다.

다음은 소화를 실행하고 성공을 보장하기위한 몇 가지 유용한 힌트입니다.

때때로 당신은 여러 효소가 특정 DNA 단편을 생성하기 위하여 이용될 필요가 있는 상황에서 자신을 찾아낼 수 있습니다. 이 경우 완충 조건과 인큐베이션 온도가 두 효소 간에 호환되는지 확인해야 하며, 그렇다면 이중 소화를 수행하고 동일한 반응으로 두 효소를 모두 절단할 수 있습니다. 때때로, 그러나, 당신은 두 효소 사이의 반응 조건에서 비호환성을 찾을 수 있습니다, 이 경우 해결 방법은 효소를 순차적으로 사용하는 것입니다. 예를 들어, 다이제스트는 먼저 하나의 효소로 수행될 수 있고, 그 후 완충 조성물은 제2 효소에 최적되기 위해 변경될 수 있다. 완충부 비호환성을 극복하고 순차적 소화를 수행하는 또 다른 방법은 초기 소화 다음 DNA를 정화한 다음 두 번째 소화를 수행하는 것입니다.

컨트롤을 사용하는 것은 다이제스트가 잘못될 수 있는 이유를 이해하는 좋은 방법입니다. 예를 들어, 효소 조절을 통해 DNA 샘플의 무결성을 확인하고 외핵증 활성이 존재하는지 확인할 수 있습니다. 알려진 제한 부위를 가진 대조DNA의 사용은 효소의 활성을 시험할 수 있게 합니다.

이제 소화가 어떻게 수행되는지 보았기 때문에 제한 효소를 사용할 수있는 다양한 방법을 살펴 볼 수 있습니다.

제한 효소는 특정 샘플을 식별하기 위해 진단적으로 사용할 수 있습니다. 소화를 특수 칩에 로드한 다음 해당 칩을 생체 분석기라고 하는 기계에 넣습니다. 연구원은 물고기 견본의 진위를 결정하기 위하여 소화에 의해 생성된 DNA 단편 크기를 검토할 수 있습니다. 주어진 종에서 동일한 유전자의 다른 밴딩 패턴, 또는이 경우 다른 종, 제한 단편 길이 다형성이라고합니다.

제한 효소는 또한 한 플라스미드에서 DNA의 단편을 분리하고 다른 플라스미드로 삽입하는 과감에 사용될 수 있으므로 원하는 단편은 박테리아를 사용하여 복제될 수 있다.

매우 특정 위치에서 유전자에 제한 부위를 도입하기 위해 중합체 연쇄 반응 또는 PCR을 채택함으로써, 제한 효소는 동일한 유전자또는 유전자의 대체 형태에서 단일 뉴클레오티드 차이의 존재를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 SNPs는 PCR 및 겔 전기포고단독으로 검출하기 어렵다. SNP 내에서 제한 사이트가 도입되면 단순 다이제스트가 올레를 구별할 수 있습니다.

당신은 제한 효소에 대한 JoVE의 비디오를 보았습니다. 이러한 효소가 어디에서 왔는지 배웠고, 어떻게 작동하는지에 대한 몇 가지 기초를 배웠으며, 소화를 설정하는 방법을 보았으며, 제한 효소가 분자 생물학에서 어떻게 사용될 수 있는지 배웠습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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