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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Digestores de enzimas de restrição

Overview

Enzimas de restrição ou endonucleases reconhecem e cortam DNA em uma sequência específica. Essas enzimas ocorrem naturalmente em bactérias como uma defesa contra bacteriófagos - vírus que infectam bactérias. Enzimas de restrição bacteriana cortam o DNA de bacteriófago invasor, deixando o DNA genômico bacteriano ileso devido à adição de grupos de metila.

Este vídeo explica os princípios básicos das enzimas de restrição, incluindo: como as enzimas de restrição são nomeadas e os tipos de sites de reconhecimento e saliências que existem. Também é fornecido um procedimento generalizado passo a passo para como configurar um digestor de restrição, incluindo os componentes necessários, a ordem em que a mistura deve ser montada e a temperatura e o tempo típicos de incubação. A importância de inativar enzimas de restrição para prevenir a atividade estelar é mencionada. Dicas para a realização de múltiplas enzimas digestões e uso de controles em reações de digestão também são fornecidas.

Procedure

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Enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são usadas em uma variedade de diferentes aplicações na biologia molecular. Essas enzimas reconhecem e cortam uma sequência específica de DNA, chamada de local de restrição. O vídeo que você está prestes a assistir fornece algumas informações de fundo sobre essas moléculas milagrosas e mostra como configurar uma enzime de restrição digestão.

De onde vêm as enzimas de restrição? Essas enzimas são uma adaptação de bactérias que agem como um mecanismo de defesa contra vírus conhecidos como bacteriófagos. Graças à adição de grupos de metila a locais de enzimas de restrição no DNA bacteriano, enzimas de restrição só reconhecem e cortam o DNA de phage, prevenindo assim a infecção.

Enzimas de restrição têm nomes bem estranhos. Por exemplo, HindiII, NotI, EcoRI e BamHI. As três primeiras letras de um nome enzimád me refere ao organismo do qual foi isolado. Por exemplo, a enzima de restrição EcoRI foi isolada da E. coli. A quarta letra, se necessário, refere-se à cepa bacteriana da qual a enzima foi isolada. O numeral romano indica se é a primeira, segunda, terceira, enzima isolada desse organismo em particular.

Enzimas de restrição reconhecem uma sequência de nucleotídeos, geralmente de quatro a oito pares de base de comprimento, chamado de local de reconhecimento. Em nucleotídeos específicos dentro da sequência, a enzima quebrará as ligações fosfodiester na espinha dorsal do DNA. Os sites de reconhecimento são geralmente palindômicos, o que significa que a sequência lê os mesmos para frente e para trás. Quando o palíndromo é encontrado em fios complementares de molécula de DNA é chamado de palíndromo invertido-repetitivo.

Enzimas de restrição podem deixar diferentes tipos de extremidades uma vez que o DNA é cortado: extremidades pegajosas e extremidades cegas. As extremidades pegajosas deixam 3' e 5' saliências enquanto as extremidades contundentes não deixam saliências. O tipo de extremidade dita como o fragmento de DNA isolado pela restrição do digestor enzimáte será recombinado com outros fragmentos de DNA em um processo conhecido como ligadura.

Uma digestão enzimápica de restrição deve ser cuidadosamente planejada. Uma reação de digestão normalmente consiste no seguinte: água deionizada, o DNA que vai ser cortado, tampão específico para a enzima que você vai usar, e às vezes uma proteína chamada albumina de soro bovino ou BSA. A BSA estabilizará a reação impedindo que a enzima grude na lateral do recipiente que abriga o digestor. Cada enzima de restrição pode potencialmente ter diferentes condições de buffer, temperaturas de incubação e requisitos para BSA. Fornecedores de enzimas de restrição terão recursos que se pode verificar para obter todas as informações necessárias.

Para começar a configurar o digestor, recupere a enzima de restrição do congelador ou da geladeira. Mantenha a enzima de restrição no gelo ou um recipiente resistente térmico para garantir que haja atividade ideal para reações futuras. A um tubo de microfuça devem ser adicionados na seguinte ordem. Primeiro, um volume de água estéril e livre de nuclease que produzirá um volume final de reação de 20μL. Em seguida, 10x Restrição Enzima Tampão, em seguida, BSA, se necessário, até 1μg de DNA, e 2-10 unidades de enzima. As unidades são definidas como a quantidade de enzima necessária para produzir um digestor completo de 1μg de DNA de controle em 60 minutos a 37°C em um volume de reação de 50μL. Depois, misture por vórtice e, em seguida, centrífuga brevemente a 12.000xg em um microcentrifuuge para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. Em seguida, incubar a uma temperatura ideal para sua enzima de restrição, geralmente 37°C em um bloco de aquecimento por 1 a 4 horas.

Uma vez que o seu digestor tenha concluído, é uma boa ideia incubar a mistura de reação a 65°C para inativar as enzimas de restrição. Embora as enzimas de restrição cortem especificamente o local na maior parte do tempo, tempos de incubação prolongados podem levar à atividade estelar, que está cortando em locais semelhantes, mas distintos de seus locais típicos de digestão.

Após a inativação, o DNA deve ser executado em um gel de agarose para garantir que o digestão tenha sido bem sucedido.

Aqui estão algumas dicas úteis para executar seus digestores e garantir o sucesso.

Às vezes você pode encontrar-se em uma situação onde múltiplas enzimas precisam ser usadas para gerar um fragmento de DNA específico. Neste caso, você precisa verificar se as condições do tampão e as temperaturas de incubação são compatíveis entre as duas enzimas, se assim for, então você pode realizar uma digestão dupla e ter ambas as enzimas cortadas na mesma reação. Às vezes, no entanto, você encontrará incompatibilidade nas condições de reação entre as duas enzimas, e neste caso a solução alternativa é usar as enzimas sequencialmente. Por exemplo, o digestor pode ser realizado com uma enzima primeiro, e, em seguida, a composição do buffer, pode ser alterada para ser ideal para a segunda enzima. Outra maneira de superar a incompatibilidade do buffer e realizar um digestão sequencial é purificar o DNA após a digestão inicial e, em seguida, realizar a segunda digestão.

Usar controles é uma boa maneira de entender por que uma digestão pode dar errado. Por exemplo, um controle sem enzimas permitirá verificar a integridade da amostra de DNA e determinar se a atividade exonuclease está presente. O uso de DNA de controle com locais de restrição conhecidos permite que a atividade da enzima seja testada.

Agora que vimos como os digestos são realizados, vamos dar uma olhada em várias maneiras de enzimas de restrição podem ser usadas.

Enzimas de restrição podem ser utilizadas diagnosticicamente, a fim de identificar amostras específicas. Carregando um digestor em um chip especializado e, em seguida, colocando esse chip em uma máquina chamada bioanalzer. Os pesquisadores podem examinar os tamanhos dos fragmentos de DNA, produzidos pelo digestor, a fim de determinar a autenticidade das amostras de peixes. Os diferentes padrões de banda do mesmo gene de uma determinada espécie, ou neste caso diferentes espécies, são chamados de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição.

Enzimas de restrição também podem ser usadas no subcloamento para isolar um fragmento de DNA de um plasmídeo e inserir em outro, para que o fragmento desejado possa ser replicado usando bactérias.

Ao empregar a reação da cadeia de polimerase, ou PCR para introduzir locais de restrição em genes em locais muito específicos, enzimas de restrição podem ser usadas para determinar a presença de diferenças de nucleotídeos únicos em formas alternativas do mesmo gene, ou alelo. Estes polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs, são difíceis de detectar apenas com PCR e eletroforese gel. Com a introdução do local de restrição dentro do SNP, um simples digestor pode distinguir entre os alelos.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre enzimas de restrição. Você aprendeu de onde essas enzimas vêm, foi ensinado alguns fundamentos sobre como elas funcionam, viu como configurar um digestor, e aprendeu como enzimas de restrição podem ser usadas em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!

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