Name: Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:23:02.000Z
Description: Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
<p>שיבוט מולקולרי הוא קבוצה של טכניקות המשמשות להחדרת DNA רקומביננטי ממקור פרוקריוטי או אאוקריוטי לרכב משכפל כגון פלסמידים או וקטורים ויראליים. שיבוט מתייחס ליצירת עותקים רבים של שבר DNA של עניין, כגון גן. בסרטון זה תלמד על השלבים השונים של שיבוט מולקולרי, כיצד להגדיר את ההליך, ויישומים שונים של טכניקה זו.</p>
</div>
<div id="script_1">
<p>לפחות שתי מולקולות דנ"א חשובות נדרשות לפני תחילת השיבוט. ראשית, והכי חשוב, אתה צריך את שבר ה- DNA שאתה הולך לשכפל, הידוע גם בשם להוסיף.  זה יכול לבוא פרוקריוטה, אאוקריוטה, אורגניזם נכחד, או שזה יכול להיווצר באופן מלאכותי במעבדה. באמצעות שיבוט מולקולרי אנו יכולים ללמוד יותר על הפונקציה של גן מסוים.</p>
<p>שנית, אתה צריך וקטור.  וקטור הוא DNA פלסמיד המשמש ככלי בביולוגיה מולקולרית כדי ליצור עותקים נוספים של חלבון או לייצר חלבון גן מסוים. פלסמידים הם דוגמה לווקטור, והם עגולים, כרומוזומליים נוספים, DNA המשוכפל על ידי חיידקים.</p>
<p>פלסמיד בדרך כלל יש אתר שיבוט מרובים או MCS, אזור זה מכיל אתרי זיהוי עבור אנדונקולאזים הגבלה שונים הידוע גם בשם אנזימי הגבלה. תוספות שונות ניתן לשלב לתוך plasmid על ידי טכניקה הנקראת קשירה. וקטור הפלסמיד מכיל גם מקור של שכפול, המאפשר לו להיות משוכפל בחיידקים. בנוסף, לפלסמיד יש גן אנטיביוטי. אם חיידקים משלבים את הפלסמיד, הוא ישרוד במדיה המכילה את האנטיביוטיקה. זה מאפשר את הבחירה של חיידקים שעברו שינוי בהצלחה.</p>
<p>ההוספה והווקטור משובטים לתוך אורגניזם של תאים מארחים, הנפוץ ביותר בשימוש בשיבוט מולקולרי הוא E. coli. E. coli גדל במהירות, זמין באופן נרחב ויש לו וקטורים שיבוט שונים רבים המיוצרים מסחרית. אוקריוטים, כמו, שמרים יכולים לשמש גם כאורגניזמים מארחים לווקטורים.   </p>
<p>השלב הראשון של הליך השיבוט המולקולרי הכללי הוא להשיג את ההוספה הרצויה, אשר ניתן לגזור מ- DNA או mRNA מכל סוג תא. הווקטור האופטימלי והאורגניזם המארח שלו נבחרים לאחר מכן על בסיס סוג ההוספה ומה ייעשה בסופו של דבר עם זה.  תגובת שרשרת פולימראז, או שיטה מבוססת PCR משמש לעתים קרובות כדי לשכפל את ההוספה.</p>
<p>לאחר מכן על ידי שימוש בסדרה של תגובות אנזימטיות, הכנס ועיכול מחוברים יחד ומוכנסים לאורגניזם המארח לשכפול המוני. וקטורים משוכפלים מטוהרים מחיידקים, ובעקבות עיכול מוגבל, מנותחים על ג'ל.  שברים מטוהרים ג'ל נשלחים מאוחר יותר לרצף כדי לוודא כי הכניסה היא שבר ה- DNA הרצוי.</p>
</div>
<div id="script_2">
<p>בואו נסתכל קצת יותר מפורט על אופן השיבוט המולקולרי. לפני שתתחיל, אתה רוצה לתכנן את אסטרטגיית השיבוט שלך, לפני ביצוע כל ניסיון שיבוט על הספסל.  לדוגמה, כל וקטור plasmid נתון, יספק לך מספר סופי של אתרי הגבלה לשלב את ההוספה דרך אתר שיבוט מרובים.  יהיה עליך לבחור אתרי הגבלה שלא נמצאו בהוספה שלך כדי שלא תדבק בה. אתה עלול להישאר עם מצב שבו אתה נאלץ להצטרף שבר קצה קהה עם אחד שיש לו overhang.  אם כן, אז באמצעות קטע klenow כדי להגדיר קשירת קצה קהה עשוי להיות האפשרות היחידה שלך כדי לקבל את ההוספה לתוך הווקטור הרצוי שלך.  הבנת כלי השיבוט המולקולריים השונים העומדים לרשותכם, כמו גם לבוא עם אסטרטגיה זהירה לפני שתתחיל שיבוט יכול להיות חיסכון זמן עצום.</p>
<p>מקור ה- DNA לשיבוט מולקולרי יכול להיות מבודד כמעט מכל סוג של דגימת תא או רקמה באמצעות טכניקות מיצוי פשוטות. לאחר בידוד, ניתן להשתמש ב- PCR כדי להגביר את ההוספה.</p>
<p>ברגע שהתוספת מוגברת הן היא והן הווקטור מתעכלים על ידי אנזימי הגבלה, הידועים גם בשם אנדונקולאזים מגבילים.</p>
<p>לאחר העיכול, ניתן להפעיל את ההוספה והווקטור על ג'ל ולטוהר על ידי תהליך הנקרא טיהור ג'ל. ביחס לווקטור, צעד זה יעזור לטהר פלסמיד ליניארי מפלסמיד לא מלוטש, אשר נוטה להופיע ככתם משקל מולקולרי גבוה על ג'ל.</p>
<p>לאחר ג'ל טיהור התקציר, התוסף הוא קשירה או מחובר plasmid, באמצעות אנזים הנקרא ligase DNA.</p>
<p>באופן כללי, זה תמיד רעיון טוב להגדיר קשירה, כך היחס של להוסיף לווקטור הוא 3 ל 1, אשר מבטיח כי רק כמות קטנה של וקטור יהיה ligate עצמית. לאחר שקשירת הקרח נקבעה על קרח, היא מדגירה בין 14-25 מעלות צלזיוס בין שעה ללילה.</p>
<p>לאחר מכן, טרנספורמציה מבוצעת כדי להציג את וקטור plasmid לתוך המארח כי ישכפל אותו. </p>
<p>חיידקי טרנספורמציה הבאים מצופים על צלחות אגר עם אנטיביוטיקה ודגרה לילה ב 37°C.  מכיוון שהפלסטימיד מכיל גן עמיד לאנטיביוטיקה, טרנספורמציה מוצלחת תייצר מושבות חיידקיות כאשר יגדלו על לוחות אגר בנוכחות אנטיביוטיקה. לאחר מכן ניתן לקטוף מושבות בודדות מהצלחת שהשתנתה, להציב אותה למדיית צמיחה נוזלית בצינורות ממוספרים, ולהכניס אותה לאינקובטור רועד להתרחבות. נפח קטן של תרבות נוזלית מתווסף לצלחת אגר ממוספרת, בעוד שאר התרבות עוברת לטיהור פלסמיד. ערכת המספור המציינת את זהותן של מושבות חיידקים שמהן ינוצלו הפלסמידים בסופו של דבר נשמרת לאורך כל תהליך הטיהור של פלסמיד.    </p>
<p>דגימה של פלסמיד מטוהר נחתכת לאחר מכן עם אנזימי הגבלה. לאחר מכן התקציר נטען ומופעל על הג'ל על מנת לבדוק את נוכחותו של הכנס, אשר יוודא כי מושבת החיידקים השתנתה עם plasmid המכיל תוספת ולא פלסמיד קשירה עצמית.  חיידקים שאומתו כי השתנו עם plasmid המכילה, מורחבים לטיהור פלסמיד נוסף. רצף משמש כצעד אימות סופי כדי לאשר כי גן העניין שלך שוכפל.</p>
</div>
<div id="script_3">
<p>שיבוט מולקולרי יכול לשמש עבור מספר כמעט בלתי מוגבל של יישומים.  לדוגמה, כאשר תבנית mRNA מתומללת לאחור ליצירת cDNA, או DNA משלים, על-ידי אנזים הנקרא תעתיק הפוך ולאחר מכן PCR משמש להגברת ה- cDNA, ניתן להשתמש בשיבוט מולקולרי ליצירת ספריית cDNA – ספריה של כל הגנים המבוטאים על-ידי סוג תא נתון.</p>
<p>שיבוט מולקולרי יכול לשמש גם כדי לקחת סדרה של גנים, או אשכול גנים מזן חיידקי אחד, לארגן אותם מחדש לפלסמידים שהופכים בזן אחר, כך שניתן ליצור מסלול ביוסינתזה שלם כדי לייצר מולקולה מורכבת.</p>
<p>באמצעות שיבוט מולקולרי, ניתן ליצור ספריית מוטציות על ידי הבעת פלסמיד מטרה בזן חיידקי מיוחד המשתמש בפולימראז נוטה שגיאה כאשר הוא מתרבת בטמפרטורות מסוימות. המוטציות יכולות להיות מאופיינות ברצף. חיידקים שעברו טרנספורמציה עם גנים מוטנטיים יכולים להיבדק עם תרופות או כימיקלים שונים כדי לראות אילו מושבות חיידקים התפתחו כדי להיות עמידות לתרופות. </p>
<p>הודות לשיבוט מולקולרי, ניתן לשלב גנים עיתונאיים בפלסטיות DNA, גן עיתונאי נפוץ הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP, הפולט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר הם נחשפים לאור UV. גן כתב יכול גם להיות מוכנס לתוך וירוס אלפא כדי להראות זיהום יתושים ו transmissibility בתאים.</p>
</div>
<div id="script_4">
<p>הרגע צפית בסרטון של ג'ובים על שיבוט מולקולרי. עכשיו אתה צריך להבין איך שיבוט מולקולרי עובד ואיך הטכניקה יכולה לשמש בביולוגיה מולקולרית. כמו תמיד, תודה שצפית!</p>
</div>

שיבוט מולקולרי

Molecular Cloning

<p>שיבוט מולקולרי הוא מערכת של שיטות, המשמשות להחדרת דנ"א רקומביננטי לווקטור - נשא של מולקולות דנ"א שישכפלו שברי דנ"א רקומביננטיים באורגניזמים מארחים.  שבר הדנ"א, שעשוי להיות גן, יכול להיות מבודד מדגם פרוקריוטי או אאוקריוטי.  לאחר בידוד של שבר העניין, או להוסיף, הן הווקטור ואת ההוספה חייב להיות חתוך עם אנזימי הגבלה מטוהר.  החלקים המטוהרים מחוברים יחד למרות טכניקה הנקראת קשירה.  האנזים שמזרז את תגובת קשירה ידוע בשם ליגאז.</p>
<p>וידאו זה מסביר את השיטות העיקריות המשולבות, בד בבד, כדי לכלול את הליך השיבוט המולקולרי הכולל.  היבטים קריטיים של שיבוט מולקולרי נדונים, כגון הצורך באסטרטגיית שיבוט מולקולרי וכיצד לעקוב אחר מושבות חיידקים שעברו טרנספורמציה.    כמו כן מוזכרים שלבי אימות, כגון בדיקת plasmid מטוהר לנוכחות של הוספה עם מגבלות ורצף.</p>

שיクלוניקה מולקולרית (Molecular cloning) היא קבוצה של שיטות המשמשות להחדרת DNA רקומביננטי לתוך וקטור – נשא של מולקולות DNA שישכפלו את ה-DNA הרקומביננטי...

Education

JoVE Science Education

JoVE לחינוך מדעי

Basic Biology

ביולוגיה בסיסית

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

שיטות בסיסיות בביולוגיה תאית ומולקולרית

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

שימוש בהמסיטומימטר לספירת תאים

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

העברת תאים

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

PCR: תגובת שרשרת פולימראז

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

אלקטרופורזה של ג'ל דנ"א

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

טרנספורמציה חיידקית: שיטת הלם החום

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

טרנספורמציה חיידקית: אלקטרופורציה

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

שיטת אליסה

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

טיהור פלסמיד

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

טיהור ג'ל

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

הכתם המערבי

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

מבוא לתעתיק

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

תגובות קשירת DNA

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

תקציר אנזימי הגבלה

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

This collection demonstrates how to execute basic techniques commonly used in cellular and molecular biology.

בוחן תרגול על שיクלוניקה מולקולרית: מקטע מוכנס (insert), וקטור, פלסמידים, וקטורים ויראליים, אנזימי הגבלה, ליגציה, PCR, טרנספורמציה, טהרה בג'ל וריצוף. חזרו על השלבים המשמשים לשכפול DNA רקומביננטי לתוך *E. coli* או שמרים, ובדקו יישומים כגון ספריות cDNA, ספריות מוטנטים, מסלולים ביוסינתטיים וגנים מדווחים כגון GFP.

מהי המטרה העיקרית של שיクול מולקולרי?

מקטע ה-DNA המשוכפל נקרא {{slot:blank_1}}.

איזו טענה מתארת בצורה הטובה ביותר וקטור פלסמיד?

האזור בפלסמיד המכיל אתרי זיהוי עבור אנזימי הגבלה שונים נקרא {{slot:dropdown_1}}.

.E. coli הוא אורגניזם המארח הנפוץ ביותר המשמש בשיクלוניקה מולקולרית

מהו הסדר הכללי הנכון של שלבי השבט הראשוניים?

טיהור בג'ל יכול לסייע בהפרדת פלסמיד ליניארי מפלסמיד שאינו חתוך.

מדוע יחס של 3:1 בין המכנס (insert) לווקטור מומלץ לעיתים קרובות עבור ליגציה?

לאחר הרחבת מושבות שעברו טרנספורמציה, מהי מטרת החיתוך של פלסמיד מופק באמצעות אנזימי הגבלה והרצתו על ג'ל?

איזו יישום משתמש ב-mRNA שעבר תעתוק הפוך וב-PCR כדי ליצור ספרייה של גנים המבטאים סוג תא מסוים?

תרגול: שיבוט מולקולרי Quiz

בחון הערכה זה מכסה מושגי יסוד בשעתוק מולקולרי, כולל מאפיינים מרכזיים של וקטורי פלסמיד, אסטרטגיית ליגציה באמצעות יחסי רצף מוחדר-לוקטור, ברירה באמצעות אנטיביוטיקה לאחר טרנספורמציה בקטריאלית, ביטוי רפורטר מבוסס GFP, וזרימת העבודה הסטנדרטית שלאחר השעתוק המשמשת לאימות של מבנים רקומביננטיים.

Video Quiz

בוחן הערכה זה מכסה שיטות ליבה בביולוגיה תאית ומולקולרית, כולל ספירת תאים ובדיקת חיוניות באמצעות המציטומטר, תרבית תאים והעברה (passaging), תכנון ומחזורי PCR, אלקטרופורזה וטיהור של DNA בג'ל, SDS-PAGE ואימונובלוטינג (immunoblotting), טרנספורמציה בקטריאלית באמצעות הלם תרמי ואלקטרופורציה, זיהוי חלבונים מבוסס ELISA וטיהור פלסמידים.

Chapter Quiz

ביולוגיה בסיסית - פרק 2: שיטות בסיסיות בביולוגיה תאית ומולקולרית

Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education