Name: Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:23:02.000Z
Description: Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
<p>Klonowanie molekularne to zestaw technik stosowanych w celu wprowadzenia rekombinowanego DNA z organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego do nośnika replikacyjnego, takiego jak plazmidy lub wektory wirusowe. Klonowanie polega na tworzeniu licznych kopii interesującego fragmentu DNA, na przykład genu. W tym filmie dowiedzą się Państwo o poszczególnych etapach klonowania molekularnego, sposobie przygotowania procedury oraz o różnych zastosowaniach tej techniki.</p>
</div>
<div id="script_1">
<p>Przed rozpoczęciem klonowania wymagane są co najmniej dwie ważne cząsteczki DNA. Po pierwsze i najważniejsze, niezbędny jest fragment DNA, który ma zostać sklonowany, znany również jako insert. Może on pochodzić od prokariota, eukariota, organizmu wymarłego lub może zostać stworzony sztucznie w laboratorium. Dzięki klonowaniu molekularnemu możemy dowiedzieć się więcej o funkcji konkretnego genu.</p>
<p>Po drugie, potrzebny jest wektor. Wektor to plazmidowy DNA wykorzystywany w biologii molekularnej jako narzędzie do powielania określonego genu lub produkcji z niego białka. Plazmidy są przykładem wektora; stanowią one koliste, pozachromosomalne DNA replikowane przez bakterie.</p>
<p>Plazmid posiada zazwyczaj wielostronnicową stronę klonowania (multiple cloning site) lub MCS; obszar ten zawiera miejsca rozpoznawania dla różnych endonukleaz restrykcyjnych, znanych również jako enzymy restrykcyjne. Różne inserty mogą zostać włączone do plazmidu za pomocą techniki zwanej ligacją. Wektor plazmidowy zawiera również sekwencję początku replikacji (origin of replication), która umożliwia jego replikację w bakteriach. Dodatkowo plazmid posiada gen oporności na antybiotyk. Jeśli bakterie włączą plazmid, przeżyją w pożywce zawierającej dany antybiotyk. Pozwala to na selekcję bakterii, które zostały pomyślnie przekształcone.</p>
<p>Insert i wektor są klonowane w organizmie gospodarza; najczęściej stosowanym w klonowaniu molekularnym jest E. coli. E. coli szybko rośnie, jest powszechnie dostępna i posiada liczne komercyjnie produkowane wektory klonujące. Eukarioty, takie jak drożdże, mogą również służyć jako organizmy gospodarze dla wektorów.</p>
<p>Pierwszym krokiem ogólnej procedury klonowania molekularnego jest pozyskanie pożądanego insertu, który może zostać wyizolowany z DNA lub mRNA dowolnego typu komórek. Następnie, w zależności od rodzaju insertu i planowanego zastosowania, dobierany jest optymalny wektor oraz organizm gospodarz. Do powielenia insertu często stosuje się metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli PCR.</p>
<p>Następnie, za pomocą serii reakcji enzymatycznych, insert i produkt trawienia są łączone i wprowadzane do organizmu gospodarza w celu masowej replikacji. Zreplikowane wektory są oczyszczane z bakterii, a po trawieniu restrykcyjnym analizowane na żelu. Fragmenty oczyszczone z żelu są następnie przesyłane do sekwencjonowania, aby zweryfikować, czy insert jest pożądanym fragmentem DNA.</p>
</div>
<div id="script_2">
<p>Przyjrzyjmy się nieco dokładniej temu, jak przebiega klonowanie molekularne. Przed rozpoczęciem prac przy stole laboratoryjnym należy zaplanować strategię klonowania. Przykładowo, każdy dany wektor plazmidowy zapewnia ograniczoną liczbę miejsc restrykcyjnych do wprowadzenia wstawki za pomocą polilinkera (MCS). Należy wybrać takie miejsca restrykcyjne, które nie występują w wstawce, aby jej nie przeciąć. Może zdarzyć się sytuacja, w której konieczne będzie połączenie fragmentu o tępych końcach z fragmentem z nawisami. W takim przypadku użycie fragmentu Klenowa w celu przygotowania ligacji tępych końców może być jedyną opcją wprowadzenia wstawki do pożądanego wektora. Znajomość dostępnych narzędzi klonowania molekularnego oraz opracowanie starannej strategii przed rozpoczęciem prac może znacząco zaoszczędzić czas.</p>
<p>DNA będące źródłem do klonowania molekularnego można wyizolować z niemal każdego rodzaju komórek lub próbek tkankowych za pomocą prostych technik ekstrakcji. Po izolacji można zastosować PCR w celu amplifikacji wstawki.</p>
<p>Po amplifikacji wstawka oraz wektor są trawione enzymami restrykcyjnymi, znanymi również jako endonukleazy restrykcyjne.</p>
<p>Po trawieniu wstawkę i wektor można poddać elektroforezie w żelu i oczyścić w procesie zwanym oczyszczaniem z żelu. W przypadku wektora etap ten pomaga oddzielić zlinearyzowany plazmid od plazmidu nieprzeciętego, który w żelu ma tendencję do pojawiania się jako smuga o wysokiej masie cząsteczkowej.</p>
<p>Po oczyszczeniu z żelu produktów trawienia, wstawka jest ligowana, czyli łączona z plazmidem, za pomocą enzymu zwanego ligazą DNA.</p>
<p>Zasadniczo zawsze warto przygotować ligację tak, aby stosunek wstawki do wektora wynosił 3:1, co zapewnia, że tylko niewielka ilość wektora ulegnie samoligacji. Po przygotowaniu ligacji na lodzie, inkubuje się ją w temperaturze od 14-25˚C przez okres od 1 h do całej nocy.</p>
<p>Następnie przeprowadza się transformację, aby wprowadzić wektor plazmidowy do gospodarza, który będzie go replikował.</p>
<p>Po transformacji bakterie wysiewa się na płytki z agarem z antybiotykiem i inkubuje przez noc w 37°C. Ponieważ plazmid zawiera gen oporności na antybiotyk, udana transformacja doprowadzi do powstania kolonii bakteryjnych podczas wzrostu na płytkach z agarem w obecności antybiotyków. Pojedyncze kolonie można następnie pobrać z płytki po transformacji, przenieść do płynnych pożywek w ponumerowanych probówkach i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w celu namnożenia. Mała objętość kultury płynnej jest nakładana na ponumerowaną płytkę z agarem, natomiast reszta kultury przechodzi do etapu oczyszczania plazmidu. System numeracji określający tożsamość kolonii bakteryjnych, z których docelowo zostaną oczyszczone plazmidy, jest zachowany przez cały proces oczyszczania plazmidów.</p>
<p>Próbka oczyszczonego plazmidu jest następnie trawiona enzymami restrykcyjnymi. Produkt trawienia nanosi się na żel i poddaje elektroforezie, aby sprawdzić obecność wstawki, co potwierdzi, że kolonia bakteryjna została przekształcona plazmidem zawierającym wstawkę, a nie plazmidem samoligowanym. Bakterie, u których potwierdzono transformację plazmidem z wstawką, są namnażane w celu dalszego oczyszczania plazmidów. Jako ostatni etap weryfikacji wykonuje się sekwencjonowanie, aby potwierdzić, że geny zainteresowania zostały sklonowane.</p>
</div>
<div id="script_3">
<p>Klonowanie molekularne może być wykorzystywane w niemal nieograniczonej liczbie zastosowań. Na przykład, gdy matryca mRNA jest odwrotnie przepisywana w celu utworzenia cDNA, czyli komplementarnego DNA, przez enzym zwany odwrotną transkryptazą, a następnie stosuje się PCR w celu amplifikacji cDNA, klonowanie molekularne może zostać wykorzystane do stworzenia biblioteki cDNA – biblioteki wszystkich genów eksprymowanych przez dany typ komórek.</p>
<p>Klonowanie molekularne może być również wykorzystane do pobrania serii genów lub klastra genów z jednego szczepu bakteryjnego i ich reorganizacji w plazmidach, które są następnie transformowane do innego szczepu, co pozwala na odtworzenie całego szlaku biosyntetycznego w celu produkcji złożonej cząsteczki.</p>
<p>Poprzez klonowanie molekularne można wygenerować bibliotekę mutantów, eksprymując docelowy plazmid w specjalnym szczepie bakteryjnym, który wykorzystuje polimerazę podatną na błędy podczas hodowli w określonych temperaturach. Mutacje można scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania. Bakterie transformowane zmutowanymi genami można następnie testować różnymi lekami lub chemikaliami, aby sprawdzić, które kolonie bakterii wyewoluowały w kierunku oporności na dany lek.</p>
<p>Dzięki klonowaniu molekularnemu do plazmidów DNA można włączyć geny reporterowe; powszechnym genem reporterowym jest zielone białko fluorescencyjne lub GFP, które emituje zieloną fluorescencję pod wpływem światła UV. Gen reporterowy można również wprowadzić do alfawirusa, aby wykazać infekcję u komarów oraz zdolność do transmisji w komórkach.</p>
</div>
<div id="script_4">
<p>Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat klonowania molekularnego. Powinni Państwo teraz rozumieć, jak przebiega proces klonowania molekularnego i w jaki sposób technika ta może być wykorzystana w biologii molekularnej. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!</p>
</div>

klonowanie molekularne

Molecular Cloning

<p>Klonowanie molekularne to zespół metod służących do wprowadzenia rekombinowanego DNA do wektora – nośnika cząsteczek DNA, który będzie replikował fragmenty rekombinowanego DNA w organizmach gospodarzach. Fragment DNA, którym może być gen, można wyizolować z próbki prokarjotycznej lub eukarjotycznej. Po wyizolowaniu interesującego fragmentu, czyli insertu, zarówno wektor, jak i insert muszą zostać przecięte enzymami restrykcyjnymi i oczyszczone. Oczyszczone fragmenty są łączone za pomocą techniki zwanej ligacją. Enzym katalizujący reakcję ligacji to ligaza.</p>
<p>W niniejszym filmie wyjaśniono główne metody, które są łączone w tandemie, aby stworzyć pełną procedurę klonowania molekularnego. Omówiono kluczowe aspekty klonowania molekularnego, takie jak konieczność opracowania strategii klonowania oraz sposób monitorowania przekształconych kolonii bakteryjnych. Wspomniano również o etapach weryfikacji, takich jak sprawdzanie oczyszczonego plazmidu pod kątem obecności wstawki za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz sekwencjonowania.</p>

Klonowanie molekularne

Klonowanie molekularne to zestaw metod stosowanych do wprowadzania rekombinowanego DNA do wektora – nośnika cząsteczek DNA, który będzie replikował rekombinowane...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Podstawy biologii

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

Używanie hemekytometru do liczenia komórek

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

Komórki pasażujące

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

PCR: reakcja łańcuchowa polimerazy

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

Elektroforeza żelu DNA

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

Oddzielanie białka za pomocą SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Przemiana bakteryjna: metoda szoku cieplnego

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

Przemiana bakteryjna: elektroporacja

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

Metoda ELISA

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

Oczyszczanie plazmidu

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

Oczyszczanie żelu

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

Zachodnia plama

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

Wprowadzenie do transfekcji

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

Reakcje ligacji DNA

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

Trawienie enzymów restrykcyjnych

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

This collection demonstrates how to execute basic techniques commonly used in cellular and molecular biology.

Quiz praktyyczny z klonowania molekularnego: insert, wektor, plazmidy, wektory wirusowe, enzymy restrykcyjne, ligacja, PCR, transformacja, oczyszczanie żelowe i sekwencjonowanie. Przegląd etapów klonowania rekombinowanego DNA w komórkach E. coli lub drożdży oraz analiza zastosowań, takich jak biblioteki cDNA, biblioteki mutantów, szlaki biosyntetyczne i geny reporterowe, np. GFP.

Jaki jest główny cel klonowania molekularnego?

Fragment DNA, który zostaje sklonowany, nazywa się {{slot:blank_1}}.

Które stwierdzenie najlepiej opisuje wektor plazmidowy?

Obszar plazmidu zawierający miejsca rozpoznawania dla różnych enzymów restrykcyjnych nazywany jest {{slot:dropdown_1}}.

E. coli jest najczęściej stosowanym organizmem gospodarzem w klonowaniu molekularnym.

Jaka jest prawidłowa ogólna kolejność wczesnych etapów klonowania?

Oczyszczanie żelowe może pomóc w oddzieleniu zlinearyzowanego plazmidu od plazmidu nieciętego.

Dlaczego w przypadku ligacji często zaleca się stosowanie stosunku insertu do wektora wynoszącego 3:1?

Po namnożeniu kolonii po transformacji, jaki jest cel trawienia oczyszczonego plazmidu enzymami restrykcyjnymi i przeprowadzenia elektroforezy żelowej?

Która aplikacja wykorzystuje odwrotną transkrypcję mRNA i PCR do stworzenia biblioteki genów wykazujących ekspresję w danym typie komórek?

Ćwiczenie: Klonowanie molekularne Quiz

Niniejszy quiz sprawdzający obejmuje podstawowe koncepcje klonowania molekularnego, w tym kluczowe cechy wektorów plazmidowych, strategię ligacji z wykorzystaniem stosunków wkładki do wektora, selekcję antybiotykową po transformacji bakteryjnej, ekspresję reportera opartego na GFP oraz standardowy schemat postępowania po klonowaniu stosowany w celu weryfikacji konstruktów rekombinowanych.

Video Quiz

Niniejszy quiz oceniający obejmuje podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej, w tym liczenie komórek i ocenę ich żywotności za pomocą komory licznikowej (hemacytometru), pasażowanie komórek i warunki hodowli, projektowanie i cykle PCR, elektroforezę żelową i oczyszczanie DNA, SDS-PAGE i immunoblotting, transformację bakteryjną metodą szoku termicznego i elektroporacji, detekcję białek metodą ELISA oraz oczyszczanie plazmidów.

Chapter Quiz

Podstawy biologii - Rozdział 2: Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education