Name: Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:23:02.000Z
Description: Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
<p>Moleküler klonlama, prokaryotik veya ökaryotik bir kaynaktan gelen rekombinant DNA'nın plazmidler veya viral vektörler gibi replike olan bir taşıyıcıya yerleştirilmesinde kullanılan bir dizi tekniktir. Klonlama, bir gen gibi ilgi duyulan bir DNA fragmanının çok sayıda kopyasının oluşturulmasını ifade eder. Bu videoda, moleküler klonlamanın farklı aşamalarını, prosedürün nasıl kurulacağını ve bu tekniğin farklı uygulama alanlarını öğreneceksiniz.</p>
</div>
<div id="script_1">
<p>Klonlama işlemi başlamadan önce en az iki önemli DNA molekülü gereklidir. İlk ve en önemlisi, klonlayacağınız, insert olarak da bilinen DNA fragmanına ihtiyacınız vardır. Bu fragman bir prokaryottan, ökaryottan, nesli tükenmiş bir organizmadan gelebilir veya laboratuvarda yapay olarak oluşturulabilir. Moleküler klonlama kullanarak belirli bir genin fonksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.</p>
<p>İkinci olarak, bir vektöre ihtiyacınız vardır. Vektör, belirli bir genden daha fazla kopya oluşturmak veya bir protein üretmek için moleküler biyolojide araç olarak kullanılan plazmid DNA'dır. Plazmidler bir vektör örneğidir ve bakteriler tarafından replike edilen dairesel, ekstrakromozomal DNA'lardır.</p>
<p>Bir plazmid tipik olarak çoklu klonlama bölgesine veya MCS'ye sahiptir; bu bölge, restriksiyon enzimleri olarak da bilinen farklı restriksiyon endonükleazlar için tanıma bölgeleri içerir. Ligasyon adı verilen bir teknikle farklı insertler plazmide dahil edilebilir. Plazmid vektörü ayrıca, bakterilerde replike edilmesini sağlayan bir replikasyon başlangıç noktası (origin of replication) içerir. Ek olarak, plazmid bir antibiyotik genine sahiptir. Eğer bakteriler plazmidi bünyelerine katarlarsa, antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalırlar. Bu, başarıyla transforme edilmiş bakterilerin seçilmesine olanak tanır.</p>
<p>Insert ve vektör, bir konak hücre organizmasına klonlanır; moleküler klonlamada en yaygın kullanılan E. coli'dir. E. coli hızlı büyür, yaygın olarak bulunur ve ticari olarak üretilmiş çok sayıda farklı klonlama vektörüne sahiptir. Maya gibi ökaryotlar da vektörler için konak organizmalar olarak kullanılabilir.</p>
<p>Genel moleküler klonlama prosedürünün ilk adımı, herhangi bir hücre tipinden DNA veya mRNA'dan türetilebilen istenen inserti elde etmektir. Ardından, insertin tipine ve nihayetinde onunla ne yapılacağına bağlı olarak optimal vektör ve konak organizması seçilir. Inserti replike etmek için genellikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR tabanlı bir yöntem kullanılır.</p>
<p>Ardından, bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak insert ve digest birleştirilir ve kitlesel replikasyon için konak organizmaya aktarılır. Replike edilen vektörler bakterilerden saflaştırılır ve restriksiyon sindirimi sonrası jel üzerinde analiz edilir. Jel saflaştırmalı fragmanlar, insertin istenen DNA fragmanı olduğunu doğrulamak için daha sonra sekanslamaya gönderilir.</p>
</div>
<div id="script_2">
<p>Moleküler klonlamanın nasıl gerçekleştirildiğine biraz daha detaylıca bakalım. Başlamadan önce, laboratuvarda herhangi bir klonlama denemesi yapmadan önce klonlama stratejinizi planlamak isteyeceksiniz. Örneğin, herhangi bir plazmit vektörü, insert'ü çoklu klonlama bölgesi (MCS) aracılığıyla dahil etmeniz için size sınırlı sayıda restriksiyon bölgesi sunacaktır. Insert'ü parçalamamak için, insert içerisinde bulunmayan restriksiyon bölgelerini seçmeniz gerekecektir. Küt uçlu (blunt end) bir fragmanı, çıkıntılı (overhang) bir fragmanla birleştirmek zorunda kaldığınız bir durumla karşılaşabilirsiniz. Eğer öyleyse, insert'ü istediğiniz vektöre yerleştirmek için tek seçeneğiniz klenow fragmanı kullanarak küt uçlu bir ligasyon kurmak olabilir. Elinizdeki çeşitli moleküler klonlama araçlarını anlamak ve klonlamaya başlamadan önce dikkatli bir strateji geliştirmek, size çok ciddi bir zaman kazandırabilir.</p>
<p>Moleküler klonlama için DNA kaynağı, basit ekstraksiyon teknikleri aracılığıyla hemen hemen her türlü hücre veya doku örneğinden izole edilebilir. İzole edildikten sonra, insert'ü çoğaltmak için PCR kullanılabilir.</p>
<p>Insert çoğaltıldıktan sonra, hem insert hem de vektör, restriksiyon endonükleazları olarak da bilinen restriksiyon enzimleri ile sindirilir.</p>
<p>Sindirildikten sonra, insert ve vektör bir jelde yürütülebilir ve jel saflaştırma adı verilen bir işlemle saflaştırılabilir. Vektörle ilgili olarak bu adım, lineerleşmiş plazmitin, jelde yüksek moleküler ağırlıklı bir yayılma (smear) şeklinde görünme eğiliminde olan kesilmemiş plazmitlerden saflaştırılmasına yardımcı olacaktır.</p>
<p>Sindirilen ürünler jelde saflaştırıldıktan sonra, insert, DNA ligaz adı verilen bir enzim aracılığıyla plazmite liglanır veya eklenir.</p>
<p>Genel olarak, ligasyonları insert'ün vektöre oranının 3'e 1 olacağı şekilde kurmak her zaman iyi bir fikirdir; bu, yalnızca az miktarda vektörün kendi kendine liglanmasını sağlar. Ligasyon buz üzerinde kurulduktan sonra, 14-25˚C arasında 1 saatten gece boyuna kadar inkübe edilir.</p>
<p>Ardından, plazmit vektörü, onu replike edecek konağa aktarmak için transformasyon gerçekleştirilir.</p>
<p>Transformasyonu takiben bakteriler, antibiyotikli agar plakalara ekilir ve 37°C'de gece boyu inkübe edilir. Plazmit bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden, başarılı transformasyon, antibiyotiklerin varlığındaki agar plakalarda büyütüldüğünde bakteri kolonileri oluşturacaktır. Daha sonra transformasyon plağından tekil koloniler seçilebilir, numaralandırılmış tüplerdeki sıvı besiyerlerine yerleştirilebilir ve çoğaltılmak üzere çalkalamalı inkübatöre konulabilir. Sıvı kültürün küçük bir hacmi numaralandırılmış bir agar plakaya eklenirken, kültürün geri kalanı plazmit saflaştırma aşamasına geçer. Plazmitlerin nihayetinde saflaştırılacağı bakteri kolonilerinin kimliğini belirten numaralandırma şeması, plazmit saflaştırma işlemi boyunca korunur.</p>
<p>Ardından, saflaştırılmış plazmitin bir örneği restriksiyon enzimleri ile kesilir. Sindirim ürünü, insert'ün varlığını kontrol etmek için jele yüklenir ve yürütülür; bu, bakteri kolonisinin kendi kendine liglanmış bir plazmitle değil, insert içeren bir plazmitle transforme edildiğini doğrulayacaktır. Insert içeren bir plazmitle transforme olduğu doğrulanan bakteriler, daha fazla plazmit saflaştırması için çoğaltılır. İlgi duyduğunuz genin klonlandığını onaylamak için son doğrulama adımı olarak dizileme (sequencing) işlemi gerçekleştirilir.</p>
</div>
<div id="script_3">
<p>Moleküler klonlama, neredeyse sınırsız sayıda uygulama için kullanılabilir. Örneğin, bir mRNA kalıbı, ters transkriptaz adı verilen bir enzim tarafından cDNA'ya (komplementer DNA) ters transkribe edildiğinde ve ardından cDNA'yı çoğaltmak için PCR kullanıldığında, moleküler klonlama ile bir cDNA kütüphanesi —belirli bir hücre tipi tarafından eksprese edilen tüm genlerin kütüphanesi— oluşturulabilir.</p>
<p>Moleküler klonlama ayrıca, bir bakteri suşundan bir dizi genin veya gen kümesinin alınması ve bunların başka bir suşa transforme edilecek plazmidler şeklinde yeniden organize edilmesi için de kullanılabilir; böylece karmaşık bir molekül üretmek için tüm bir biyosentetik yolak yeniden oluşturulabilir.</p>
<p>Moleküler klonlama aracılığıyla, belirli sıcaklıklarda kültüre edildiğinde hata eğilimli bir polimeraz kullanan özel bir bakteri suşunda hedef bir plazmid eksprese edilerek mutant bir kütüphane oluşturulabilir. Mutasyonlar, dizileme ile karakterize edilebilir. Mutant genlerle transforme edilmiş bakteriler daha sonra farklı ilaçlar veya kimyasallar ile test edilerek, hangi bakteri kolonilerinin ilaç direncine sahip olacak şekilde evrimleştiği görülebilir.</p>
<p>Moleküler klonlama sayesinde, DNA plazmidlerine rapor genler dahil edilebilir; yaygın bir rapor gen, UV ışığına maruz kaldığında yeşil floresans yayan yeşil floresan protein veya GFP'dir. Bir rapor gen, sivrisineklerde enfeksiyonu ve hücrelerde bulaşıcılığı göstermek için bir alfavirüse de yerleştirilebilir.</p>
</div>
<div id="script_4">
<p>JoVE'nin moleküler klonlama hakkındaki videosunu izlediniz. Artık moleküler klonlamanın nasıl çalıştığını ve bu tekniğin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!</p>
</div>

moleküler klonlama

Molecular Cloning

<p>Moleküler klonlama, rekombinant DNA'yı bir vektöre - rekombinant DNA fragmanlarını konak organizmalarda replike edecek olan bir DNA molekülü taşıyıcısına - yerleştirmek için kullanılan bir dizi yöntemdir. Bir gen olabilen DNA fragmanı, prokaryotik veya ökaryotik bir örnekten izole edilebilir. İlgilenilen fragmanın veya insertin izolasyonunun ardından, hem vektör hem de insert restriksiyon enzimleri ile kesilmeli ve saflaştırılmalıdır. Saflaştırılan parçalar, ligasyon adı verilen bir teknikle birbirine bağlanır. Ligasyon reaksiyonunu katalize eden enzim ligaz olarak bilinir.</p>
<p>Bu video, genel moleküler klonlama prosedürünü oluşturmak için birlikte, ardışık olarak kullanılan temel yöntemleri açıklamaktadır. Moleküler klonlama stratejisinin gerekliliği ve transforme edilmiş bakteri kolonilerinin nasıl takip edileceği gibi moleküler klonlamanın kritik yönleri ele alınmaktadır. Ayrıca, saflaştırılmış plazmidin restriksiyon sindirimleri ve sekanslama ile insert varlığı açısından kontrol edilmesi gibi doğrulama adımlarına da değinilmektedir.</p>

Moleküler Klonlama

Moleküler klonlama, rekombinant DNA'yı bir vektöre —rekombinant DNA'yı replike edecek bir DNA molekülü taşıyıcısına— yerleştirmek için kullanılan bir dizi yöntemdir...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Temel Biyoloji

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

Hücreleri Saymak için Hematitometre Kullanma

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

Geçiş Hücreleri

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

PCR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

DNA Jel Elektroforezi

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

SDS-PAGE ile Proteinin Ayrılması

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bakteriyel Dönüşüm: Isı Şoku Yöntemi

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

Bakteriyel Dönüşüm: Elektroporasyon

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

ELISA Yöntemi

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

Plazmid Saflaştırma

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

Jel Arıtma

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

Batı Lekesi

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

Transfeksiyona Giriş

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

DNA Ligasyon Reaksiyonları

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

Restriksiyon Enzim Sindirimleri

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

hücresel ve moleküler biyolojide temel yöntemler

Bu koleksiyonda hücresel ve moleküler biyolojide sıkça kullanılan temel tekniklerin nasıl uygulanacağı gösterilmektedir.

Moleküler klonlama üzerine uygulama testi: insert, vektör, plazmitler, viral vektörler, restriksiyon enzimleri, ligasyon, PCR, transformasyon, jel saflaştırma ve sekanslama. Rekombinant DNA'nın E. coli veya mayaya klonlanmasında kullanılan adımları gözden geçirin; cDNA kütüphaneleri, mutant kütüphaneleri, biyosentetik yolaklar ve GFP gibi raporlayıcı genler gibi uygulamaları kontrol edin.

Moleküler klonlamanın temel amacı nedir?

Klonlanan DNA fragmanı {{slot:blank_1}} olarak adlandırılır.

Hangi ifade bir plazmit vektörünü en iyi şekilde tanımlar?

Bir plazmidin farklı restriksiyon enzimleri için tanıma bölgeleri içeren alanına {{slot:dropdown_1}} denir.

E. coli, moleküler klonlamada en yaygın kullanılan konak organizmadır.

Erken klonlama basamaklarının doğru genel sırası nedir?

Jel purifikasyonu, lineerize edilmiş plazmidin kesilmemiş plazmidden ayrılmasına yardımcı olabilir.

Ligasyon için neden genellikle 3:1 insert-vektör oranı önerilir?

Transforme edilmiş koloniler çoğaltıldıktan sonra, saflaştırılmış bir plazmidin restriksiyon enzimleri ile kesilmesinin ve jelde yürütülmesinin amacı nedir?

Hangi uygulama, bir hücre tipi tarafından eksprese edilen genlerin bir kütüphanesini oluşturmak için ters transkripsiyonla elde edilmiş mRNA ve PCR'ı kullanır?

Moleküler Klonlama Quiz

Bu değerlendirme testi; temel plazmit vektör özellikleri, ekleme-vektör oranlarını kullanan ligasyon stratejisi, bakteriyel transformasyon sonrası antibiyotikli seçim, GFP tabanlı raporlayıcı ekspresyonu ve rekombinant yapıları doğrulamak için kullanılan standart klonlama sonrası iş akışı dahil olmak üzere temel moleküler klonlama kavramlarını kapsamaktadır.

Video Quiz

Bu değerlendirme testi; hemositometre ile hücre sayımı ve canlılık analizi, hücre pasajlama ve kültür koşulları, PCR tasarımı ve döngüleri, DNA jel elektroforezi ve saflaştırma, SDS-PAGE ve immunoblotting, ısı şoku ve elektroporasyon yoluyla bakteriyel transformasyon, ELISA tabanlı protein tespiti ve plazmit saflaştırma dahil olmak üzere temel hücresel ve moleküler biyoloji yöntemlerini kapsamaktadır.

Chapter Quiz

Temel Biyoloji - Bölüm 2: Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

Watch how Molecular Cloning works through a 10-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Molecular Cloning | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education