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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Molekulare Klonierung

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Das molekulare Klonieren besteht aus verschiedenen Methoden, um rekombinante DNA von prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen in sich replizierende Vehikel, wie zum Beispiel Plasmide oder virale Vektoren, einzufügen. Die Klonierung bezieht sich auf die Vervielfältigung eines bestimmten DNA Fragments, wie zum Beispiel einem Gen. In diesem Video lernt ihr die verschiedenen Schritte in der molekularen Klonierung, wie man das Verfahren ansetzt, und welche verschiedenen Anwendungen es für diese Methode gibt.

Mindestens zwei verschiedene DNA Moleküle werden vor der Klonierung benötigt. Erstens braucht man das DNA Fragment, welches man Klonieren möchte, was auch als Insert bezeichnet wird. Dieses DNA Fragment kann ursprünglich von prokaryotischen, eukaryotischen oder ausgestorbenen Organismen stammen, order es kann künstlich im Labor erzeugt worden sein. Durch die molekulare Klonierung kann man mehr über die Funktion eines bestimmten Gens lernen.

Zweitens braucht man einen Vektor. Ein Vektor ist Plasmid-DNA, die als „Werkzeug“ in der molekularen Biologie verwendet wird, um mehr Kopien oder ein Protein von einem bestimmen Gen herzustellen. Plasmide gehören zur Gruppe der Vektor-DNA. Sie sind ringförmig und extrachromosomal und werden durch Bakterien repliziert.

Ein Plasmid enthält normalerweise eine multiple Klonierungstelle oder MCS. Diese Stelle enthält Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsendonukleasen, oder Restriktionsenzyme. Verschiedene DNA Fragmente können in das Plasmid durch eine Methode, die man Ligation nennt, eingefügt werden. Der Plasmid-Vektor enthält außerdem einen Replikationsursprung, der es den Bakterien ermöglicht das Plasmid zu replizieren. Außerdem hat das Plasmid ein Antibiotikaresistenz-Gen. Wenn Bakterien das Plasmid aufnehmen, können sie in antibiotikumhaltigen Medium überleben. Das ermöglicht die Selektion der Bakterien, die erfolgreich transformiert worden sind.

Das DNA Fragment und der Vektor werden in einen Wirtsorganismus kloniert. Der am häufigsten verwendete Wirt in der molekularen Klonierung ist E.coli. E.coli vermehrt sich schnell und ist überall verfügbar, und außerdem gibt es dafür unzählige kommerziell erhältliche Klonierungsvektoren. Eukaryoten, wie zum Beispiel Hefe, können auch als Wirte für Vektoren verwendet werden.

Der erste Schritt in einem allgemeinen Klonierungsverfahren ist es das gewünschte DNA Fragment zu erhalten, welches von DNA oder mRNA von fast allen Zellarten stammen kann. Dann sucht man sich den optimalen Vektor und Wirt aus, abhängig von der Art des DNA Fragments und davon was letztendlich mit dem Fragment gemacht werden soll. Eine Polymerase Kettenreaktion, oder PCR, wird oft durchgeführt, um ein DNA Fragment zu vervielfältigen.

Dann werden eine Reihe von enzymatischen Reaktionen angesetzt, um das DNA Fragment und den Verdau zusammenzufügen und in einen Wirtsorganismus zur massenhaften Vervielfältigung einzufügen. Die vervielfältigten Vektoren werden dann aus den Bakterien aufgereinigt und nach einem Restriktionsverdau mit einem Gel analysiert. Die aufgereinigten Fragmente werden sequenziert, um sicherzustellen, dass es sich um das richtige Fragment handelt.

Nun schauen wir uns an wie molekulares Klonieren im Detail funktioniert. Bevor man auf der Laborbank anfängt, sollte man die Klonierungsstrategie genau planen. Zum Beispiel stellt jeder Plasmid-Vektor eine bekannte Anzahl von Restriktionsseiten zur Verfügung, inwelche das DNA Fragment in die multiple Klonierungsstelle eingefügt werden kann. Man muss sich Restriktionsseiten aussuchen, die nicht in dem DNA Fragment enthalten sind, damit man es nicht zerschneidet. Es kann möglich sein, dass man ein stumpfes Ende mit einem Ende zusammenkleben muss, das einen Überhang hat. Wenn das der Fall ist, ist die Benutzung des Klenow Fragments meist die einzige Option, um eine Ligation mit stumpfen Enden anzusetzen und dadurch das DNA Fragment in den Vektor zu klonieren. Das Verstehen der verschiedenen Klonierungsmethoden, die einem zur Verfügung stehen und das sorgfältige Planen der Klonierungsschritte kann einem sehr viel Zeit sparen.

Die Quelle der DNA für die Klonierung kann von fast jeder Zellart oder jedem Gewebe durch einfache Extraktionsmethoden isoliert werden. Nach der Isolation kann man ein PCR durchführen, um das DNA Fragment zu amplifizieren.

Wenn das DNA Fragment amplifiziert ist, muss es, wie auch der Vektor, mit Restriktionsenzymen, oder Restriktionsendonukleasen, geschnitten werden.

Nach dem Verdau werden das DNA Fragment und der Vektor auf einem Gel gelaufen und mit einem Vefahren, das man Gelaufreinigung nennt, aufgereinigt. Für den Vektor heißt das, dass man das linearisierte Plasmid von dem ungeschnittenen Plasmid trennen kann, welches normalerweise als undefinierte Bande mit höherer Molekularmasse auf dem Gel erscheint.

Nachdem man die Verdaue auf gereinigt hat, ligiert, oder klebt, man das DNA Fragment mit einem Enzym, das DNA Ligase genannt wird, in das Plasmid.

Im allgemeinen ist es immer eine gute Idee die Ligation so anzusetzen, dass das Verhältnis zwischen DNA Fragment und Vektor 3:1 beträgt. Damit stellt man sicher, dass nur ein kleiner Teil des Vektors mit sich selbst ligiert. Nachdem die Ligationsreaktion auf Eis angesetzt wurde, wird sie zwischen 15-25˚C von 1 Stunde-bis über Nacht inkubiert.

Danach wird die Transformation durchgeführt, um den Plasmid-Vektor in den Wirt einzufügen, der ihn repliziert.

Nach der Transformation werden die Bakterien auf antibiotikumhaltigen Agarplatten bei 37˚C über Nacht inkubiert. Da das Plasmid das Antibiotikumresistenz-Gen enthält, können nur erfolgreich transformierte Bakterien auf den antibiotikumhaltigen Agarplatten wachsen. Einzelne Kolonien können dann von der transformierten Platte selektiert und in flüssiges Nährmedium in nummerierten Reaktionsgefäßen überführt werden, worin sie dann in einen schüttelnden Inkubator für die Vervielfältigung gestellt werden. Ein kleines Volumen dieser flüssigen Kultur wird auf eine nummerierte Agarplatte aufgetragen und der Rest wird für die Plasmidaufreinigung verwendet. Das Nummerierungsschema, mit dem man die Identität der bakteriellen Kolonien festhält, von denen man das Plasmid aufreinigt hat, wird während des ganzen Verfahrens beibehalten.

Eine Probe des auf gereinigten Plasmids wird dann mit Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird danach auf ein Gel aufgetragen um die Anwesenheit des DNA Fragments zu prüfen. Damit stellt man sicher, dass die bakterielle Kolonie wirklich mit einem Plasmid transformiert worden ist, welches ein DNA Fragment enthält, und nicht mit einem Plasmid, das mit sich selbst ligiert ist. Die Bakterien, die das DNA Fragment wirklich enthalten, werden dann weiter für die Plasmidaufreinigung expandiert. Der letzte Validierungsschritt ist normalerweise das Sequenzieren, um sicherzustellen dass das richtige Gen kloniert worden ist.

Das molekulare Klonieren kann für quasi unbegrenzte Anwendungen genutzt werden. Zum Beispiel wenn eine mRNA durch die Reverse Transkriptase in cDNA (oder komplementäre DNA) umgeschrieben wird, kann ein PCR durchgeführt werden, um die cDNA zu amplifizieren. Das molekulare Klonieren kann dann benutzt werden, um eine cDNA Bibliothek herzustellen, die alle Gene enthält, die in einem Zelltyp exprimiert werden.

Die molekulare Klonierung kann auch benutzt werden, um eine Reihe von Genen, oder ein Gencluster, von einem bakteriellen Stamm in verschiedene Plasmide neu zu organisieren und dann in einen anderen Stamm zu transformieren, um einen ganzen biosynthetischen Pfad nachzustellen oder ein komplexes Molekül zu produzieren.

Durch das Exprimieren eines Ziel-Plasmids in speziellen Bakterien, welche bei bestimmten Temperaturen eine fehleranfällige Polymerase benutzten, kann man mit Hilfe der molekularen Klonierung eine Mutationsbibliothek herstellen. Diese Mutationen können dann durch Sequenzieren analysiert werden. Bakterien, die mit diesen mutierten Genen transformiert worden sind, können dann benutzt werden, um verschiedene Medikamente oder Chemikalien zu testen, wodurch man sieht welche Bakterienstämme eine Resistenz entwickelt haben.

Dank der molekularen Klonierung können auch Reportergene in DNA Plasmide integriert werden. Ein häufig verwendetes Reportergen ist das grün fluoreszierende Protein, oder GFP, welches eine grüne Fluoreszenz emittiert wenn es UV Licht ausgesetzt wird. Ein Reportergen kann auch in den Alphavirus eingefügt werden, um eine Infektion in Mücken und die Übertragbarkeit in Zellen anzuzeigen.

Das war die Einführung in die molekulare Klonierung von JoVE. Ihr solltet nun verstehen wie das molekulare Klonieren funktioniert und wie diese Methode in der molekularen Biologie angewandt wird. Wie immer, danke für eure Aufmerksamkeit.

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