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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

분자 복제는 재조합 DNA를 벡터에 삽입하는 데 사용되는 일련의 방법입니다 - 숙주 유기체에서 재조합 DNA 단편을 복제할 DNA 분자의 담체. 유전자일 지도 모르다 DNA 단편은, 대핵계 또는 진핵 시편에서 분리될 수 있습니다. 관심 있는 단편을 분리한 후, 또는 삽입, 벡터와 삽입모두 제한 효소로 절단하고 정제되어야 한다. 정제 된 조각은 결찰이라는 기술을 가지고 결합됩니다. 결찰 반응을 촉매하는 효소는 리게아제라고 합니다.

이 비디오는 전체 분자 복제 절차를 구성하기 위해 결합되는 주요 방법을 함께 설명합니다. 분자 복제의 중요한 양상은 분자 복제 전략의 필요성과 변형 된 박테리아 식민지를 추적하는 방법과 같이 논의됩니다. 인서트가 있는 경우 소화 및 시퀀싱이 제한되는 것을 확인하는 것과 같은 검증 단계도 언급된다.

Procedure

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분자 복제는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 복제 차량에 대막 또는 진핵 소스에서 재조합 DNA를 삽입하는 데 사용되는 일련의 기술입니다. 복제는 유전자와 같은 관심있는 DNA 단편의 수많은 사본을 만드는 것을 말합니다. 이 비디오에서는 분자 복제의 다양한 단계, 절차를 설정하는 방법 및이 기술의 다른 응용 프로그램에 대해 배울 수 있습니다.

복제가 시작되기 전에 적어도 두 개의 중요한 DNA 분자가 필요합니다. 첫째, 그리고 가장 중요한 것은, 그렇지 않으면 삽입으로 알려진 복제하려고하는 DNA 단편이 필요합니다. 그것은 prokaryote, 진핵생물, 멸종된 유기체에서 올 수 있습니다, 또는 실험실에서 인위적으로 생성될 수 있습니다. 분자 복제를 사용하여 특정 유전자의 기능에 대해 자세히 알아볼 수 있습니다.

둘째, 벡터가 필요합니다. 벡터는 특정 유전자에서 단백질을 더 많이 복사하거나 생산하는 분자 생물학의 도구로 사용되는 플라스미드 DNA입니다. 플라스미드는 벡터의 예이며, 박테리아에 의해 복제되는 원형, 여분의 염색체, DNA이다.

플라스미드는 일반적으로 여러 복제 사이트 또는 MCS를 가지고 있으며,이 영역은 제한 효소라고도 하는 다른 제한 엔토나클로스에 대한 인식 부위를 포함합니다. 다른 인서트가 계합이라는 기술에 의해 플라스미드에 통합될 수 있다. 플라스미드 벡터는 또한 복제의 기원을 포함하고, 이는 박테리아에서 복제 할 수 있습니다. 또한, 플라스미드에는 항생제 유전자가 있다. 박테리아가 플라스미드를 통합하면 항생제를 함유한 미디어에서 살아남을 수 있습니다. 이것은 성공적으로 변형 된 박테리아의 선택을 허용합니다.

삽입 및 벡터는 숙주 세포 유기체로 복제되며, 분자 복제에 가장 일반적으로 사용되는 것은 대장균이다. 대장균은 급속히 성장하고, 널리 이용 가능하며, 상업적으로 생산되는 수많은 다른 복제 벡터를 가지고 있다. 진핵생물은, 같이, 효모는 또한 벡터를 위한 호스트 유기체로 이용될 수 있습니다.

일반적인 분자 복제 절차의 첫 번째 단계는 임의의 세포 유형으로부터 DNA 또는 mRNA로부터 유래될 수 있는 원하는 삽입을 얻는 것이다. 최적의 벡터와 호스트 유기체는 삽입 유형과 궁극적으로 그것으로 수행 될 것입니다 기반으로 선택됩니다. 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR 기반 방법은 종종 인서트를 복제하는 데 사용됩니다.

그런 다음 일련의 효소 반응을 사용하여 삽입 및 소화가 함께 결합되어 대량 복제를 위해 숙주 유기체로 도입됩니다. 복제된 벡터는 박테리아로부터 정제되고, 겔에서 분석된 제한 소화에 따라 정제된다. 겔 정제 된 단편은 나중에 시퀀싱을 위해 보내져 인세트가 원하는 DNA 단편인지 확인합니다.

분자 복제가 어떻게 진행되는지 좀 더 자세히 살펴보겠습니다. 시작하기 전에 벤치에서 복제 를 시도하기 전에 복제 전략을 계획할 것입니다. 예를 들어, 지정된 플라스미드 벡터는 여러 복제 사이트를 통해 삽입을 통합하는 제한 사이트의 유한 수를 제공합니다. 삽입에 없는 제한 사이트를 선택해야 만 크리브하지 않도록 해야 합니다. 오버행이 있는 무딘 끝 조각과 결합해야 하는 상황이 남아 있을 수 있습니다. 그렇다면 klenow 조각을 사용하여 무딘 끝 결찰을 설정하는 것이 원하는 벡터에 삽입을 얻을 수있는 유일한 옵션이 될 수 있습니다. 다양한 분자 복제 도구를 이해하고 복제를 시작하기 전에 신중한 전략을 마련하는 것은 엄청난 시간 절약이 될 수 있습니다.

분자 복제를 위한 DNA의 근원은 간단한 추출 기술을 통해 세포 또는 조직 견본의 거의 모든 모형에서 격리될 수 있습니다. 일단 분리되면 PCR을 사용하여 인서트를 증폭시킬 수 있습니다.

삽입이 증폭되면 그 것과 벡터는 제한 엔노나셀리스라고도 하는 제한 효소에 의해 소화된다.

일단 소화되면, 삽입 및 벡터는 젤에서 실행되고 겔 정제에게 불린 프로세스에 의해 정제될 수 있습니다. 벡터에 대하여, 이 단계는 젤에 높은 분자량 얼룩으로 나타나는 경향이 있는 절단되지 않은 플라스미드에서 선형화된 플라스미드를 정화하는 것을 도울 것입니다.

소화를 정화하는 젤 후, 삽입은 DNA 리개질이라는 효소를 통해 플라스미드에 결합되거나 결합된다.

일반적으로, 삽입대 벡터의 비율이 3 대 1이기 때문에 소량의 벡터만 자체 리게이트되도록 항상 결찰을 설정하는 것이 좋습니다. 얼음 에 결찰이 설정되면 14-25 °C에서 하룻밤 사이에 배양됩니다.

그런 다음 플라스미드 벡터를 복제하는 호스트에 변환을 도입합니다.

변환 박테리아는 항생제와 천접시에 도금되고 37°C에서 하룻밤 동안 배양됩니다. 플라시미드는 항생제 내성 유전자를 함유하고 있기 때문에, 항생제가 있는 한천 판에서 재배할 때 성공적인 변환은 세균성 식민지를 생성할 것입니다. 개별 식민지는 변형 된 플레이트에서 수확 할 수 있습니다, 번호가 튜브에 액체 성장 매체로 배치, 확장을위한 흔들리는 인큐베이터에 넣어. 소량의 액체 배양은 번호가 매겨진 한고판에 추가되고, 나머지 배양은 플라스미드 정화로 이동합니다. 플라스미드가 결국 정화될 세균성 식민지의 정체성을 나타내는 번호 매기기 계획은 플라스미드 정화 과정을 통해 유지된다.

정제 된 플라스미드의 샘플은 제한 효소로 절단됩니다. 소화는 삽입물의 존재를 확인하기 위해 겔에 적재되고 실행되며, 이는 세균 식민지가 삽입을 포함하는 플라스미드로 변형되었는지 확인하고 자가 계각 플라스미드가 아닙니다. 삽입플라스미드로 변형된 것으로 확인된 박테리아는, 플라스미드 정화를 위해 확장된다. 시퀀싱은 관심 유전자가 복제되었는지 확인하기 위해 최종 검증 단계로 수행됩니다.

분자 복제는 거의 무한한 수의 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, mRNA 템플릿이 cDNA 또는 상호 DNA를 형성하기 위해 전사될 때, 역전사라고 불리는 효소에 의해 다음 PCR이 cDNA를 증폭시키는 데 사용될 때, 분자 복제는 cDNA 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있다 - 주어진 세포 유형에 의해 표현된 모든 유전자의 라이브러리.

분자 복제는 또한 일련의 유전자, 또는 한 세균성 균주에서 유전자 클러스터를 취하고, 다른 균주에서 변형되는 플라스미드로 재구성하기 위해 사용될 수 있으므로 전체 생합성 경로를 재현하여 복잡한 분자를 생성할 수 있습니다.

분자 복제를 통해, 돌연변이 라이브러리는 특정 온도에서 배양할 때 오류가 발생하기 쉬운 중합체를 사용하는 특수 세균 균주에서 표적 플라스미드를 표현함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 시퀀싱을 특징으로 할 수 있습니다. 돌연변이 유전자로 변형된 박테리아는 그 때 어떤 세균성 식민지가 약 저항이 있기 위하여 진화한지 보기 위하여 다른 약 또는 화학물질로 시험될 수 있습니다.

분자 복제 덕분에, 리포터 유전자는 DNA 플라스미드에 통합될 수 있고, 일반적인 리포터 유전자는 UV 빛에 드러날 때 녹색 형광을 방출하는 녹색 형광 단백질 또는 GFP입니다. 기자 유전자는 또한 세포에 있는 모기에 있는 감염 및 형질성을 보여주기 위하여 알파바이러스로 삽입될 수 있습니다.

분자 복제에서 JoVEs 비디오를 방금 시청했습니다. 분자 복제가 어떻게 작동하는지, 그리고 분자 생물학에서 이 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 이해해야 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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