Overview
Drosophila melanogaster, comumente conhecida como moscas-das-frutas, é um organismo modelo frequentemente usado para pesquisas em ciências da vida. Embora começar uma coleção dessas criaturas possa parecer tão fácil quanto deixar uma banana no balcão da cozinha por muito tempo, uma colônia de moscas produtiva no laboratório requer uma criação e manutenção cuidadosas.
Este vídeo demonstra os passos necessários para manter um estoque de mosca saudável. A visão geral começa com a preparação e armazenamento da levedura e mídia contendo açúcar na qual as moscas se alimentam. Em seguida, os navios mais utilizados para abrigar Drosophila são mostrados, bem como como e quando mover moscas entre esses contêineres. Por fim, a apresentação também inclui exemplos de como as condições de moradia e alimentação são manipuladas para experimentos biológicos.
Procedure
A pesquisa bem sucedida de Drosophila melanogaster depende da manutenção correta e da criação deste valioso organismo modelo. O vídeo a seguir discutirá as etapas necessárias para fornecer nutrição adequada, moradia e manuseio da mosca.
Embora comumente conhecida como mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster na verdade subsiste nos microrganismos, como a levedura, que crescem na fermentação de frutas. No laboratório, a dieta da mosca é modificada para fins práticos. Várias receitas estão disponíveis, e todas contêm os componentes essenciais: açúcar e levedura. A seguinte receita é da Universidade de Indiana em Bloomington, famosa por sua vasta variedade de estoques de moscas. Consiste em: água estéril, levedura, farinha de soja, farinha de milho amarela, ágar para textura, xarope de milho e ácido propiônico para inibir o mofo e o crescimento bacteriano. Esses ingredientes são combinados, aquecidos, mexidos e, em seguida, distribuídos em frascos de carcaça de plástico usando uma bomba. Depois de preenchidos, os frascos são plugados com um top de algodão, embrulhados e resfriados a 4 °C. Uma vez solidificado, o alimento é esterilizado via autoclavagem.
Agora que aprendemos um pouco sobre o que as moscas comem, vamos dar uma olhada onde elas vivem e como elas são tratadas.
Uma variedade de contêineres são usados para abrigar moscas. Os frascos são usados para manutenção de moscas e contêm de forma ideal 50-100 adultos. Garrafas são usadas para culturas maiores e abrigam 300-600 moscas adultas. As incubadoras controlam o meio ambiente e são capazes de guardar centenas de frascos e garrafas. As condições normais de armazenamento para moscas são de 25 °C e 60-65% de umidade relativa.
Ao trabalhar com moscas, é importante praticar rotulagem e documentação adequadas, e manter um ambiente limpo para manter a integridade das linhas de mosca e experimentos. Um recipiente deve ser trocado quando cerca de metade das pupas se escorreram ou deixaram o invólucro pupal. As cápsulas parecerão claras.
FYI, o estágio pupal ocorre entre os estágios larval e adulto, e é o momento em que as larvas incubam e se desenvolvem em um adulto. Para identificar as cápsulas pupais como claras, segure o recipiente até uma fonte de luz e inspecione a pupa.
As moscas são transferidas para frascos com mídia fresca — um nome chique para comida de mosca — através de um processo conhecido como "virar moscas". Antes de virar moscas, inspecione a mídia em busca de integridade. Moscas não podem sobreviver com alimentos rachados com ressecamento ou contaminados com mofo ou bactérias.
Para virar moscas, primeiro, toque o frasco de mosca suavemente no balcão para derrubar moscas dos lados do frasco. Em seguida, remova rapidamente a rolha, e inverta as moscas do velho recipiente rapidamente em um novo. Este processo é feito rapidamente, para evitar que as moscas escapem ou sejam esmagadas pela rolha, e para evitar que moscas soltas entrem no frasco durante a capotagem.
Embora a lança de moscas seja o método preferido para a transferência em massa de Drosophila, a anesthetização é necessária para a triagem de moscas. Dois métodos de anestesia serão discutidos aqui: refrigeração e uso de dióxido de carbono. Para esfriar as moscas coloque a cultura em um congelador de -20 °C por 8-12 minutos. Em seguida, coloque moscas em um espaço de trabalho frio e plano para seleção. As moscas também podem ser anestesiadas usando frio, resfriando-as diretamente em uma superfície congelada.
O dióxido de carbono é um método preferido para a anestesia porque não causa mortalidade aguda em moscas ou perigo para o pesquisador. O sistema de entrega de CO2 é composto: de um tanque de CO2; um tubo conectado a uma agulha, para anestesiar moscas em frascos e garrafas; e um tubo conectado a uma placa de CO2 para análise sob o microscópio.
Para anestesiar moscas, insira a agulha de CO2 através da rolha. Alternativamente, bata no recipiente em uma superfície, remova a parada e inverta rapidamente as moscas em uma placa de CO2, mantendo uma vedação fechada até que as moscas fiquem imóveis. Usando um pincel ou fórceps, mova suavemente as moscas para o novo recipiente.
Para descartar moscas indesejadas, despeje-as em um necrotério de moscas, que consiste em uma grande garrafa cheia de isopropanol ou etanol e óleo mineral coberto com um funil.
Agora que vimos como as moscas são mantidas e manuseadas em laboratório, vamos dar uma olhada em como as condições de moradia e alimentação são modificadas para diferentes experimentos.
Alguns experimentos requerem habitação alternativa para conter uma maior quantidade de moscas.
Neste experimento, o pesquisador usa uma gaiola da população de moscas para coletar uma grande quantidade de embriões. Uma gaiola da população de moscas é clara, caixa de plástico capaz de segurar milhares de moscas. O pesquisador libera as moscas desejadas de várias garrafas para a gaiola da população de moscas, em seguida, coloca placas de ágar na gaiola para coletar embriões.
Alguns experimentos exigem a manipulação da dieta de moscas.
Neste experimento, o pesquisador quer observar a resposta de fuga de moscas transgênicas que expressam um canal de íon ativado pela luz em neurônios que regulam a resposta de fuga das moscas. A dieta Drosophila é suplementada com "toda trans-retinal", que é um cofator para este canal e permite que ele funcione. Isso é feito derretendo a comida e adicionando o reagente. A mosca é então exposta à luz azul que ativa o canal e induz a resposta de fuga, e o tempo levado para voar medido.
Uma variedade de condições de moradia e manuseio podem ser manipuladas para experimentação.
Neste experimento, uma elaborada "torre de poder" é criada para estudar os efeitos do exercício em Drosophila. A torre de energia é uma máquina que continuamente sobe e cai, aproveitando a resposta natural da mosca para se mover para cima, contra a gravidade, que é conhecida como "geotaxis negativas".
O desempenho das moscas exercidas na torre de potência é medido usando um ensaio Geotaxis Negativo Rápido Iterativo, ou ensaio RING para abreviar. Moscas em frascos vazios são colocadas na frente de uma câmera. Os frascos são tocados, e as distâncias subidas são registradas. Este experimento mostra que, em comparação com um exercício de grupo controle, teve um impacto positivo na atividade ao longo do tempo.
Este vídeo da JoVE cobriu a manutenção e a criação de Drosophila melanogaster. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de preparar mídia de comida voadora, identificar adequadamente a carcaça apropriada, virar moscas e realizar experimentos simples. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
