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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Drosophila Sviluppo e riproduzione

Overview

Uno dei tanti motivi che rendono Drosophila un organismo estremamente prezioso è che le basi molecolari, cellulari e genetiche dello sviluppo sono altamente conservate tra le mosche e gli eucarioti superiori come gli esseri umani. Drosophila progredisce attraverso diverse fasi di sviluppo in un processo noto come il ciclo di vita e ogni fase fornisce una piattaforma unica per la ricerca sullo sviluppo. Questo video introduce ogni fase del ciclo di vita della Drosophila e descrive in dettaglio le caratteristiche fisiche e i principali eventi di sviluppo che si verificano durante ogni fase. Successivamente, il video discute la regolazione genetica della formazione del modello, che è importante per stabilire il piano corporeo dell'organismo e specificare singoli tessuti e organi. Inoltre, questo video offre una panoramica della riproduzione di Drosophila e di come utilizzare le caratteristiche riproduttive di Drosophila per impostare un incrocio genetico. Infine, discutiamo esempi di come i principi dello sviluppo e della riproduzione di Drosophila possono essere applicati alla ricerca. Queste applicazioni includono l'interferenza dell'RNA, i saggi comportamentali dei comportamenti di accoppiamento e le tecniche di imaging dal vivo che ci consentono di visualizzare lo sviluppo come un processo dinamico. Nel complesso, questo video evidenzia l'importanza di comprendere lo sviluppo e la riproduzione in Drosophilae come questa conoscenza può essere utilizzata per comprendere lo sviluppo in altri organismi.

Procedure

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Drosophila melanogaster, sono ampiamente utilizzati come organismo modello nello sviluppo e nella riproduzione dello studio. Drosophila progredisce attraverso diverse fasi di sviluppo in un processo noto come il ciclo di vita e ogni fase fornisce una piattaforma unica per la ricerca sullo sviluppo. In questo video, presenteremo le basi dello sviluppo e della riproduzione della Drosophila, incluso come impostare una croce genetica e discuteremo di come questa ricerca può essere applicata per comprendere i processi che vanno dalla guarigione delle ferite al comportamento.

Per prima cosa, discutiamo il ciclo di vita di Drosophila. La Drosophila progredisce attraverso 4 fasi principali dello sviluppo: embrione, larva, pupa e adulto.

L'embrione è un uovo fecondato lungo circa 0,5 mm e di forma ovale. Immediatamente dopo la fecondazione, l'embrione subisce una rapida divisione mitotica senza crescita. Il nucleo zigotico subisce nove cicli di divisione nucleare, ma non subisce citochinesi, formando una cellula multi-nucleata chiamata blastoderma sinciziale. Poiché tutti i nuclei nel blastoderma sinciziale condividono un citoplasma comune, le proteine possono diffondersi liberamente, formando gradienti morfogeni, che sono importanti per stabilire il piano corporeo e il modello dei singoli organi e tessuti nella mosca. Dopo la 10a divisione nucleare, i nuclei migrano verso la periferia del blastoderma sinciziale . Dopo il 13 ° round di divisione nucleare, che si verifica circa 3 ore dopo la fecondazione, i 6000 nuclei nel blastoderma sinciziale si individualizzano formando il blastoderma cellulare . Il blastoderma cellulare contiene un monostrato di cellule e viene trasformato in una complessa struttura multistrato, in un processo noto come gastrulazione. Durante la gastrulazione, i cambiamenti di forma cellulare guidano le invaginazioni del monostrato, creando infine gli strati germinali di endoderma, mesoderma ed ectoderma. L'endoderma dà origine all'intestino, il mesoderma dà origine ai muscoli e al cuore e l'ectoderma dà origine all'epidermide e al sistema nervoso centrale. Dopo 24 ore, gli embrioni si schiudono come larve.

Le larve sono bianche con corpi segmentati simili a vermi. Strisciano in giro nel cibo umido mangiando costantemente, portando a una rapida crescita. Le larve progrediscono attraverso tre fasi: la prima instar per 24 ore, la seconda instar per altre 24 ore e la terza instar per 48 ore. La muta avviene tra ogni fase. Quando sono pronte per la pupa, le larve di terza stella lasciano la loro fonte di cibo e si attaccano a una superficie solida, come il lato di una fiala.

Le pupe sono immobili e sono inizialmente morbide e bianche ma alla fine si induriscono e diventano marroni. Per un periodo di quattro giorni, i tessuti larvali degenerano e si formano tessuti adulti. L'eclosione segna la fine dello stadio pupale e le mosche emergono da adulte.

8 ore dopo l'eclosione, gli adulti diventano sessualmente ricettivi e iniziano ad accoppiarsi, ricominciando il ciclo di vita da capo.

Il ciclo di vita completo dura circa 10 giorni a 25 °C, ma può essere influenzato dalla temperatura. Ad esempio, a 18 °C il ciclo di vita è di circa 19 giorni e a 29 °C, il ciclo di vita è di soli 7 giorni.

Durante lo sviluppo, un'attenta regolazione genetica della formazione del modello stabilisce il piano corporeo e specifica i singoli tessuti e organi. È importante sottolineare che la creazione dell'asse anteriore-posteriore definisce l'orientamento dalla testa alla coda dell'organismo ed è regolata da diversi gruppi di geni.

In primo luogo, i geni dell'effetto materno sono forniti nell'ovocita ed ereditati dalla femmina. Sono importanti nel blastoderma sinstiziale per stabilire inizialmente l'anteriore e il posteriore dell'embrione. In particolare, il genebicoide definisce la parte anteriore dell'embrione compresa la testa e il torace, mentre il gene nanos definisce la parte posteriore, compreso l'addome.

In secondo luogo, i geni di segmentazione, che sono regolati dai geni dell'effetto materno, includono i geni gap e i geni regola di coppia. I geni Gap stabiliscono un piano corporeo segmentato lungo l'asse anteriore-posteriore suddividendo ampiamente l'embrione. I geni della regola di coppia sono espressi in un modello a strisce perpendicolare all'asse anteriore-posteriore, dividendo ulteriormente l'embrione in segmenti più piccoli. Quindi i geni di polarità del segmento, come engrailed iniziano a stabilire i destini cellulari all'interno di ciascun segmento.

Infine, i geni omeotici sono responsabili della definizione di particolari strutture anatomiche, come ali e gambe. È interessante notare che l'ordine dei geni sul cromosoma riflette il modo in cui sono espressi lungo l'asse anteriore-posteriore.

La Drosophila è un organismo estremamente fertile che può produrre migliaia di progenie in una vita. Le femmine depongono centinaia di uova al giorno e continuano a fecondare le uova bene dopo l'accoppiamento.

Drosophila sono anche organismi sessualmente dimorfici, il che significa che le femmine sono fenotipicamente distinte dai maschi. In particolare, i maschi sono più piccoli delle femmine e hanno genitali esterni di colore scuro, così come più pigmento nero sui loro addominali inferiori. I maschi hanno anche una macchia di setole sulle zampe anteriori chiamate pettini sessuali usati per attaccarsi alla femmina durante l'accoppiamento. Queste distinte differenze fenotipiche rendono molto facile distinguere i maschi dalle femmine, il che è particolarmente utile quando si imposta un incrocio genetico.

Impostare un incrocio con Drosophila è una tecnica utile per studiare la genetica. Quindi iniziamo!

Il primo passo per impostare una croce è raccogliere femmine vergini del genotipo desiderato, in modo da poter controllare esattamente con quale maschio si accoppia. I Drosophila non sono in grado di accoppiarsi durante le prime 8 ore dopo l'eclosione, quindi la raccolta di adulti molto giovani garantisce la verginità. Per raccogliere le femmine appena chiuse, svuotare la fiala nell'obitorio per sbarazzarsi di tutti gli adulti. Ogni 3-4 ore, controllare la fiala per gli adulti appena chiusi e raccogliere le femmine in una nuova fiala senza maschi fino a quando non sono pronte per l'uso. Le femmine vergini sono identificate dal loro colore del corpo molto chiaro e da una macchia scura sul loro addome, nota come meconio.

Quando sei pronto per iniziare la croce, combina 4-6 maschi con 4-6 femmine vergini dei genotipi desiderati in una fiala di cibo datata e conserva a 25 ° C e 60% di umidità. Dopo 3-4 giorni, le larve saranno presenti e i genitori dovrebbero essere trasferiti in una nuova fiala, impedendo ai genitori di accoppiarsi con la progenie. Dopo circa 10 giorni, emergeranno nuovi figli e i loro fenotipi potranno essere esaminati.

Uno strumento che i ricercatori di Drosophila usano sono i cromosomi balancer che impediscono la ricombinazione genetica e contengono marcatori genetici come le ali ricci, che sono utili per determinare il genotipo corretto di una mosca. Se volevi mosche eterozigoti per due diverse mutazioni, puoi incrociare un ceppo con mutazione #1 sul cromosoma bilanciatore CyO, a un secondo ceppo con mutazione #2 anche bilanciato su CyO. Qualsiasi progenie che emerge senza ali ricci è eterozigote per entrambe le mutazioni.

Un altro strumento comunemente usato nella ricerca sulla Drosophila è il sistema UAS-GAL4, che consente ai ricercatori di esprimere o abbattere un gene in un tessuto specifico. GAL4 è un fattore di trascrizione del lievito che è guidato da un promotore specifico del tessuto e UAS è la sequenza di attivazione a monte, che controlla l'espressione del gene di interesse . Quando si incrocia una mosca con un transgene GAL4 specifico del tessuto a una mosca con un transgene UAS con il gene di interesse direttamente a valle, la proteina GAL4 lega l'UAS e guida l'espressione del gene desiderato. Ad esempio, UAS-GFP incrociato a apterous-GAL4, che è specifico per i dischi alari in pupa, esprime GFP specificamente in quelle cellule.

Ci sono molte applicazioni che possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo e la riproduzione di Drosophila. Un'applicazione sono le analisi comportamentali, in particolare il comportamento di corteggiamento. Durante il corteggiamento, il maschio si orienta verso la femmina e la segue mentre la picchietta con le zampe anteriori. Se la femmina è ricettiva, permette al maschio di montarla. Il maschio arriccia l'addome e trasferisce il liquido seminale nella femmina, un processo noto come copulazione. L'analisi di questi comportamenti di corteggiamento in vari mutanti fornisce informazioni sul controllo genetico del comportamento

Lo sviluppo della drosophila è un processo estremamente dinamico che include molti movimenti cellulari e cambiamenti di forma, che possono essere studiati tramite imaging dal vivo. Ad esempio, la chiusura dorsale durante l'embriogenesi è quando una lacuna nell'epitelio viene chiusa in modo simile a una cerniera che coinvolge la coordinazione di molti tipi di cellule. La chiusura dorsale durante lo sviluppo viene spesso utilizzata come modello per studiare la chiusura della ferita, che può avere implicazioni cliniche.

Una terza applicazione utilizzata per comprendere i processi durante lo sviluppo di Drosophila è l'interferenza dell'RNA, che abbatte l'attività dei singoli geni e può essere utilizzata in schermi genetici inversi su larga scala. Ad esempio, il dsRNA può essere iniettato negli embrioni e l'impatto dell'abbattimento del gene sullo sviluppo degli organi, ad esempio, può essere valutato. Qui, l'interferenza dell'RNA ha rivelato un gene importante per la fusione durante lo sviluppo tracheale.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla riproduzione e allo sviluppo di Drosophila melanogaster . In questo video abbiamo recensito: il ciclo di vita di Drosophila, compresi i dettagli su ogni fase di sviluppo. Abbiamo anche imparato come utilizzare le capacità riproduttive di Drosophila per studiare la genetica e impostare una croce. Infine, abbiamo imparato come lo sviluppo e la riproduzione della Drosophila siano utili per comprendere processi complessi come il comportamento, la chiusura delle ferite e lo sviluppo degli organi.

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