Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

דרוסופולה מלנוגאסטר קציר והכנה של עוברים וזחלים
 
Click here for the English version

דרוסופולה מלנוגאסטר קציר והכנה של עוברים וזחלים

Overview

עוברים וזחלים של Drosophila melanogaster קלים לתפעל ולהתפתח במהירות על ידי מנגנונים מקבילים לאורגניזמים אחרים, כולל יונקים. מסיבות אלה, חוקרים רבים משתמשים בעוברים ובזחלים כדי לענות על שאלות בתחומים מגוונים החל מביולוגיה התנהגותית ועד התפתחותית. לפני הניסויים, עם זאת, העוברים והזחלים חייבים להיות תחילה.

וידאו זה ידגים תחילה כיצד "כוסות מטילות ביצים" משמשות לאיסוף עוברים Drosophila על לוחות אגר. הקציר וההפחתה של העוברים יתוארו לאחר מכן. לאחר מכן, הסרטון ידגים כיצד לזהות ולתפעל Drosophila באחד משלושת שלבי הזחלים הבאים בשלב העובר. לבסוף, דוגמאות של כמה דרכים שבהן עוברים זבובים וזחלים משמשים במחקר ביולוגי מסופקים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קל לתפעל עוברים וזחלים של Drosophila melanogaster והתפתחותם מונחית על ידי מנגנונים הקיימים באורגניזמים אחרים, כולל יונקים. לימוד לקצור ולהכין עוברים וזחלים הוא צעד ראשוני בתהליכים ניסיוניים רבים מביולוגיה התנהגותית ועד התפתחותית. וידאו זה יכסה את השיטות הסטנדרטיות לאיסוף וקצירת עוברים וזחלים Drosophila, הליכים חיוניים בשימוש באורגניזם מודל רב תכליתי זה.

המחקר של העובר Drosophila סיפק תובנה רבה על האופן שבו הגנים מווסתים את ההתפתחות, מן mRNA המתבטא שיפוע ביוציטים, לגנים היוצרים את תוכנית הגוף החלק הקדמי עד האחורי. חלק מהגנים האלה, כמו הגנים ההומיאובוקסיים, נשמרים מאוד בין החרק הזה ליונקים.

האופי הלבבי של עוברים Drosophila מאפשר להם לעמוד בחשיפה לסביבות קשות וכימיקלים, מה שהופך אותם מעשיים מאוד ללמוד.

לאחר ההפריה זבוב נקבה אחת יכול להניח עד 100 עוברים ביום, אשר יבקע לתוך זחלים לאחר 12-15 שעות.

על מנת לתמרן עוברי Drosophila, הם חייבים להיות נאספים תחילה.

עוברים נאספים בתאי הטלת ביצים המכונים לעתים קרובות "כוסות מטילות ביצים".

כדי להרכיב את הכוס הנחת, תחילה לנקב חורים או לחתוך חלק של מיכל לכסות אותו עם חומר נקבובי כדי לאפשר אוורור. לאחר מכן להשיג צלחת אגר מיץ תפוחים או ענבים, פס זה עם משחת שמרים, ולגרד את הצלחות במרכז. נוכחות של משחת שמרים תגרם הטלת ביצים.

מוסיפים במהירות זבובים לתא הטלת הביצים, הפוך את התא כך שהצלחת נמצאת בתחתית, ואפשרו לו לדגור. לאחר זמן הדגירה הרצוי הפוך את תא הביצים לדפוק אותו על הספסל העליון כמה פעמים. הזבובים נופלים לתחתית והם מבולבלים לזמן קצר. החליפו במהירות את צלחת אגר הישנה בצלחת הטרייה בשכבות עם משחת השמרים. כדי לרכוש את העוברים בגיל הטוב ביותר לשנות את הצלחות כל 1-3 שעות.

צלחות יהיו מאות עוברים, במיוחד ליד השריטות והשמרים.

20 זבובים מכל מין אמורים לייצר 100-200 עוברים לשעה. עכשיו אפשר לקצור את העוברים.

הכלים הדרושים לקציר עוברים הם מסננת או מסננת, אשר יכול להשתנות מאוד בגודל ובמורכבות, מברשת צבע, ומים מזוקקים.

ראשית, לשחרר עוברים על ידי טבילת הצלחת עם מים מזוקקים, בעדינות צחצוח המשטח עם מברשת צבע. לאחר מכן, לסנן את הנוזל על ידי שפיכת התערובת לתוך המסננת. לשטוף את העוברים במים.

לעתים קרובות, שטיפה מלווה בהסרה — הסרת הממברנה החיצונית הקשה של העובר, או הכוריון.

Dechorionation יכול להיעשות באופן ידני באמצעות ניתוח של העובר מתוך הנדן הכוריוני. לחלופין, עוברים יכולים להיות ממוקמים לתוך 50% אקונומיקה. זה לוקח 2-10 דקות עבור chorion להתמוסס, כפי שצוין על ידי היעלמות של נספחי גב. יש לשטוף ביסודיות במים מזוקקים כדי לוודא שהעובר העירום לא ניזוק על ידי אקונומיקה. Dechorionation הוא תנאי מוקדם לטכניקות כמו מיקרו-ינון והדמיה חיה של תאים.

עכשיו שיש לך תחושה של ביולוגיה עוברית, איסוף, וקציר, בואו נעבור לשלב הבא במחזור החיים Drosophila: זחלים.

לזחלי הדרוסופילה יש שלושה שלבים של "כוכב", או מותכים. ה-instar הראשון נמשך יום אחד, השני ביום אחר, והשלישי עוד יומיים. זחלי אינסטאר הראשון והשני נמצאים במזון של הוויאל 1-3 ימים לאחר הגדרת צלב. ביום הרביעי, זחלי אינסטאר שלישי נודדים למעלה, או "משוטטים" בצידי המיכל, שם הם בסופו של דבר יוצרים פקעות הנקראות גלמים.

זחלים משמשים לעתים קרובות לניסויים בגלל הדיסקים הדמיוני שלהם. דיסקים דמיוניים הם איברים מפותחים חלקית הידועים להיות חלקים שלמים של הזבוב הבוגר. לדוגמה, דיסק עיניים דמיוני יהפוך לעין בוגרת, דיסקים של אנטנות יהפכו לאנטנות ודיסקים דמיוניים של כנף יהפכו לכנפיים. חקר הדיסקים הדמיוניים הוביל לתגליות חשובות בדרוסופילה, כגון תפקידם של גנים הומיאובוקס ביצירת דפוסים.

אוסף זחלים הוא פשוט יותר מאשר אוסף עוברים, כי זה לא דורש העברת זבובים לדיור מיוחד.

ניתן להסיר זחל בודד עם פינצטה או מרית. בעת איסוף מספר רב של זחלים בשלב מוקדם אתה יכול להשתמש בשיטת איסוף חלופית באמצעות פתרון סוכרוז, שהוא צפוף יותר מאשר הזחלים וגורם להם לצוף.

מוסיפים תמיסת סוכרוז לפויל, שמציפה זחלים למעלה. פורק את האוכל על ידי הנחת הנקריאל על סיבוב. לאחר מכן להסיר זחלים עם מברשת או פיפטה לקצור לניסויים.

עכשיו שכיסינו טכניקות איסוף וקצירה לעוברים וזחלים, עכשיו בואו נראה איך ליישם אותם לניסויים.

מכיוון שהם ניידים, זחלי Drosophila יכולים לשמש לניסויים התנהגותיים.

כאן אתה רואה "סריקה זוחלת", המשמשת להערכת התנהגות לוקומוטור Drosophila בתנאים ספציפיים. בדיקת ההסתעפות הזוחלת מודדת את המרחק שהזחל נוסע, על מנת לבחון את ההשפעות של תרופה על תפקוד מוטורי. זחלים שנאספו שקועים בתמיסת סוכרוז מסוממת שצפויה להפריע לתנועתיות.

מיקרו-ג'ק-קציה היא הליך ליצירת זבובי פירות מהונדסים גנטית, המכונים מוטציות מהונדסות, על ידי החדרת חומר גנטי מותאם אישית בצורת פלסמיד דנ"א מעגלי.

העוברים האלה מומתים על ידי גלגול פיזי שלהם על סרט דו צדדי כך שכימיקלים לא יפגעו בהם. לאחר מכן ניתן להזריק לעוברים פלסמידים המקודדים חלבונים, כמו טובולין, מותכים לחלבוני עיתונאי פלואורסצנטיים, כמו GFP. לאחר מכן ניתן לבצע ניסויים כדי לדמיין תהליכים תאיים כמו מיטוזה מקווי זבוב מהונדסים מבוססים.

עוברים יכולים לשמש כדי לדמיין את נוכחותם של תמלילים באמצעות פלואורסצנטי בהכלאה במקום.

בניסוי זה, עוברים שלמים נצפים לנוכחות של תעתיק mRNA הרצוי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. העוברים קבועים באמצעות פתרון biphasic כי dechorionates, ולכן מכין את העובר להכתמה. העוברים העירומים נמצאים בשכבה התחתונה. לאחר כתמים אימונופלואורסצנטיים, ניתן לראות את נוכחותו של החלבון הרצוי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הרגע צפית בסרטון הקציר וההכנה של ג'וב. סקרנו את האיסוף, הקציר וההכנה של עוברים וזחלים וכמה יישומים חשובים החלים על אורגניזמים בשלב מוקדם. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter