Entretien des levures

Les découvertes importantes sur la régulation du cycle cellulaire, sur l’activité de la télomèrase et sur l’autophagie dans la Saccharomyces cerevisiae, ont démontré l'utilité de cette espèce de levure comme organisme modèle pour la recherche. Les levures sont faciles à cultiver et les plasmides et souches de levures sont disponibles dans le commerce. Malgré les besoins relativement peu coûteux de la culture des levures, l’entretien de cet organisme est essentiel à la réussite des expériences. Cette vidéo vous apportera un regard interne sur la façon de cultiver et d’entretenir des souches de S. cerevisiae en laboratoire.

En biologie, les courbes de croissance représentent le changement de population des cellules sur une période de temps. Pour la levure, la courbe de croissance est obtenue en représentant la densité optique (ou "DO") à 600 nm en ordonnée, et le temps en abscisse. La densité optique ou "absorbance" est le logarithme du rapport de l’intensité de la lumière traversant sur l’intensité de lumière transmise d’une suspension de cellules de levure. La DO à une longueur d’onde donnée est mesurée grâce à un spectrophotomètre.

Lorsque l’on travaille avec des levures, la courbe de croissance de la souche de levure doit être obtenue par la mesure de DO à différents intervalles de temps. La courbe de croissance est séparée en 3 phases principales: la phase de latence, la phase exponentielle et la phase stationnaire. En phase de latence, les cellules s’acclimatent à leur environnement, elles grossissent mais ne se divisent pas. Au cours de la phase exponentielle, les cellules se divisent rapidement jusqu’au doublement de la population. Un fois les nutriments épuisés, les cellules de levure entrent dans la phase stationnaire, pendant laquelle la division cellulaire ralentit et la population de cellules reste constante.

A l’aide de la courbe de croissance, le temps de doublement de la souche peut être calculé grâce à l’équation suivante: OD1 et OD2 représentent les mesures de densités optiques et T1 et T2 les temps entre les mesures. Le temps de doublement est défini comme le temps nécessaire à la population de cellules pour doubler. Effectuez le calcul entre deux valeurs de DO en phase exponentielle, par exemple entre les valeurs 0.2 et 0.5 comme illustré ici. Un temps de doublement d'environ 90 min doit être obtenu pour des levures de type sauvage.

La connaissance du temps de doublement est avantageuse car elle vous permet de planifier vos manipulations de la journée en conséquence.

Maintenant que nous avons présenté les principes de base de la courbe de croissance de la levure, poursuivons au laboratoire et effectuons une manipulation pour la préparation de culture de cellules de levure. Les principaux constituants des milieux de culture - également appelés nourriture pour levure - sont : l’extrait de levure, la peptone et une source de sucre. L’extrait de levure est constitué du contenu des cellules de levure, à l'exception de la paroi cellulaire, et fournit les acides aminés, les vitamines, les carbohydrates et autres nutriments nécessaires à la croissance. La peptone est dérivée de viande animale ou de lait et est la source principale d’acides aminés. Une source de sucre, généralement du glucose, est ajoutée pour fournir de l’énergie aux cellules en croissance.

Après la dissolution de l’extrait de levure et de la peptone dans l’eau, stérilisez le mélange dans un autoclave. Pour générer des boîtes de gélose, ajoutez de l’agar au milieu liquide et versez le mélange dans les boîtes de Pétri en le laissant solidifier à température ambiante. Ces plaques de gélose peuvent ensuite être utilisées lors de l'isolement de souches pour la culture de colonies de levure.

Maintenant que nos milieux de culture sont prêts, comment allons-nous cultiver ces petites créatures ? Avant tout, assurez-vous que tous les instruments, les solutions et les milieux de cultures sont stériles.

Ensuite, prenez une plaque de gélose pour l’ensemencement des cellules de levure. L’ensemencement en strie est le procédé d’étalement d’un liquide de culture de levure sur une plaque de gélose en utilisant un instrument stérile. Des colonies individuelles vont se former dans ces stries. Ces colonies sont issues d’une seule cellule de levure qui peut être prélevée afin d’obtenir une population génétique pure de cellules de levure. Une fois que les plaques sont ensemencées, retournez les et placez-les 2 à 3 jours dans un incubateur à 30 °C. C’est la température optimale pour la culture de la levure.

Une fois les colonies formées, inoculez les cellules de levure dans un petit volume de milieu de culture. Inoculer signifie ici prélever une seule colonie et l’ajouter au milieu en le mélangeant brièvement. Incubez la culture dans un agitateur orbital ou rotatif à 30 °C pendant 48 heures.

Pour de plus grandes cultures de cellules, vérifiez premièrement la DO à 600 nm de la culture âgée de 2 jours au spectrophotomètre. Faites les dilutions nécessaires pour commencer avec une DO entre 0.1 et 0.2. Après dilution des cellules, placez la fiole dans l’agitateur à 30°C et laissez pousser les cellules jusqu’à la DO souhaitée.

La prochaine étape importante après l’apprentissage de la culture des S. cerevisiae est la façon de les stocker pour une utilisation ultérieure. Les levures peuvent être conservées sur plaques de gélose à 4°C pendant 3 mois. Si toutefois vous souhaitez développer une culture fraîche, assurez-vous de tout d'abord réensemencer les cellules sur une nouvelle plaque avant l’inoculation.

Pour le stockage des souches de levures durant de longues périodes, transférer une partie aliquote dans des cryotubes contenant du glycérol. Les cellules peuvent être conservées à -80 °C pendant plusieurs années.

Maintenant que vous êtes un pro de la culture des cellules de levure, voyons comment nous pouvons utiliser ces techniques essentielles en recherche scientifique. Les cellules en phase stationnaire peuvent être utilisées pour l’étude des gènes qui régulent l’instabilité du génome d’ADN lors du vieillissement. Cette vidéo montre la collecte de cellules provenant d’une culture de trois jours. Les cellules sont ensemencées sur un milieu sélectif qui empêche le développement des cellules de levure normales. Seules les cellules ayant acquis une mutation peuvent former des colonies sur ces plaques. Le nombre de colonies sur les plaques est proportionnel au niveau d’instabilité génétique dans la culture.

Un autre exemple d’étude du vieillissement s’effectue par l’analyse du cycle de vie chronologique des cellules de levure. Le vieillissement chronologique signifie une perte de viabilité cellulaire durant une période donnée et peut être étudié en cultivant des cellules liquides comme illustré ici. Dans cette vidéo, le scientifique charge plusieurs cultures sur le spectrophotomètre afin de générer plusieurs courbes de croissance qui aideront à déterminer la viabilité cellulaire.

Les cellules de levure de type sauvage en phase exponentielle représentent des cellules normales et saines qui peuvent être utilisées pour l’étude des organites eucaryotes tels que le ribosome. Dans cette vidéo, vous pouvez voir le chargement de lysat cellulaire provenant de cellules en phase exponentielle, sur un gradient de saccharose. Les cellules sont ensuite centrifugées pour sédimenter les ribosomes et le profil de ribosome est obtenu par contrôle de l’absorbance.

Vous venez de regarder l’introduction à l’élevage et l’entretien de la Saccharomyces cerevisiae de JoVE. Dans ette vidéo, nous avons présenté la courbe de croissance de la levure, la culture de cellules et le stockage des souches de levures. Merci de votre attention et n'oubliez pas de recommander cette vidéo à un ami.