Manutenzione del lievito

Le importanti scoperte della regolazione del ciclo cellulare, dell'attività della telomerasi e dell'autofagia in Saccharomyces cerevisiae,hanno dimostrato che questa specie di lievito è un prezioso organismo modello per la ricerca. Il lievito è facile da coltivare e i plasmidi e i ceppi di lievito sono disponibili in commercio. Nonostante i requisiti relativamente economici per la coltivazione del lievito, il mantenimento di questo organismo è fondamentale per esperimenti di successo. Questo video ti darà uno sguardo all'interno su come coltivare colture cellulari di lievito e mantenere i ceppi di S. cerevisiae nei laboratori.

In biologia, le curve di crescita rappresentano il cambiamento nella popolazione cellulare in un periodo di tempo. Nel lievito, la curva di crescita viene generata tracciando la densità ottica, o "OD", della coltura cellulare a 600 nm nell'asse y e il tempo sull'asse x. La densità ottica o "assorbanza" è il rapporto logaritmico tra l'intensità della luce che entra nella sospensione cellulare di lievito e l'intensità che la attraversa. L'OD a una specifica lunghezza d'onda della luce viene misurato utilizzando uno spettrofotometro.

Quando si lavora con il lievito, la curva di crescita del ceppo di lievito deve essere generata effettuando misurazioni OD a diversi intervalli di tempo. La curva di crescita del lievito è divisa in tre fasi principali: ritardo, logaritmica e fase stazionaria. Durante la fase di ritardo, le cellule si acclimatano all'ambiente e crescono di dimensioni ma non si dividono. Nella fase logaritrica, le cellule si dividono attivamente portando così al raddoppio cellulare. Una volta esauriti i nutrienti disponibili, le cellule di lievito entrano in fase stazionaria, dove la divisione cellulare rallenta e la popolazione cellulare rimane costante.

Utilizzando la curva di crescita, il tempo di raddoppio della deformazione può essere calcolato con la seguente equazione: OD1 e OD2 rappresentano le misurazioni della densità ottica e T1 e T2 sono il tempo tra le misurazioni. Il tempo di raddoppio è definito come il tempo necessario affinché una popolazione di celle raddoppi il numero di celle. Calcola tra due valori OD di fase di log, ad esempio tra i valori 0.2 e 0.5 come mostrato qui. Il lievito di tipo selvatico dovrebbe dare un valore di tempo raddoppiato di circa 90 minuti.

Conoscere il tempo di raddoppio è utile poiché ti permetterà di pianificare i tuoi esperimenti di conseguenza durante il giorno.

Ora che abbiamo coperto i dadi e i bulloni della curva di crescita del lievito, passiamo al laboratorio e facciamo alcune mani sulla preparazione per far crescere le cellule di lievito. I componenti principali dei ricchi mezzi di crescita - AKA Yeast food - sono: estratto di lievito, peptone e una fonte di zucchero. L'estratto di lievito contiene contenuti di cellule di lievito, esclusa la parete cellulare, e fornisce aminoacidi, vitamine, carboidrati e altri nutrienti necessari per la crescita. Il peptone è derivato dalla carne animale o dal latte ed è la principale fonte di aminoacidi nei mezzi di lievito. Una fonte di zucchero, in genere glucosio, viene aggiunta in quanto fornisce energia alle cellule in crescita.

Dopo aver sciolto l'estratto di lievito e il peptone in acqua, sterilizzare la miscela utilizzando un'autoclave. Per preparare piastre di lievito, aggiungere l'agar al mezzo liquido e versare la miscela in piastre, permettendole di solidificarsi a temperatura ambiente. Queste piastre possono essere utilizzate quando si striaturano ceppi per far crescere colonie di lievito.

Ora che abbiamo preparato tutti i nostri media, come possiamo far crescere le culture di queste creature da zero? Prima di tutto, assicurati che tutti gli strumenti, le soluzioni e i supporti siano sterili.

Quindi, ottenere un piatto per strisciare le cellule di lievito. No, non quel tipo di striature! La striatura è il processo di diffusione di colture di lievito liquido su piastra di agar utilizzando uno strumento sterile, come vedete qui. Attorno alle "striature" si formeranno singole colonie, che derivano da una singola cellula di lievito, che può essere raccolta, al fine di ottenere una popolazione genetica pura di cellule di lievito. Una volta che le piastre sono striate, invertire la piastra e metterla in un incubatore a 30 °C per 2 o 3 giorni. Questa è la temperatura ottimale per la crescita del lievito.

Una volta che le colonie si sono formate, inoculare le cellule di lievito in un piccolo volume di mezzi di crescita. Inoculare qui significa scegliere una singola colonia e introdurla ai media mescolandola brevemente. Incubare la coltura in uno shaker o rotatore a 30 °C per 48 ore.

Per far crescere colture più grandi di cellule, controlla prima l'OD600 della coltura di lievito di 2 giorni usando uno spettrofotometro. Effettuare le diluizioni appropriate in modo che l'OD iniziale sia approssimativamente 0,1-0,2. Dopo aver diluito le cellule, posizionare il matraccio in uno shaker a 30 °C e far crescere le cellule fino all'OD desiderato.

La prossima lezione importante dopo aver imparato a coltivare S. cerevisiae è come conservarli per un uso futuro. Il lievito coltivato su piatti può essere conservato a 4 °C fino a 3 mesi. Tuttavia, se si desidera coltivare una coltura fresca, assicurarsi di ri-strisciare le cellule su un piatto fresco prima di inoculare.

Per conservare le scorte di ceppi di lievito per lunghi periodi, aliquotare le cellule in crioviali contenenti glicerolo. Le cellule possono quindi essere conservate a -80 °C, dove possono rimanere fino a diversi anni.

Ora che sei un professionista quando si tratta di coltivare cellule di lievito, diamo un'occhiata a come possiamo applicare queste tecniche essenziali nella ricerca scientifica. Le cellule in fase stazionaria possono essere utilizzate per studiare i geni che regolano l'instabilità del DNA del genoma durante l'invecchiamento. Questo video clip mostra la raccolta di cellule da una cultura di tre giorni. Sono placcati su mezzi selettivi che impediscono alle normali cellule di lievito di crescere. Solo le cellule che hanno acquisito una mutazione possono formare colonie su queste placche. Il numero di colonie sulle placche è proporzionale al livello di instabilità genomica nella coltura.

Un altro esempio di studio dell'invecchiamento è l'analisi della durata cronologica della vita delle cellule di lievito. L'invecchiamento cronologico denota la perdita di vitalità cellulare per un periodo di tempo e può essere studiato coltivando colture liquide come mostrato qui. In questo video, lo scienziato sta caricando varie colture sulle specifiche al fine di generare curve di crescita, che aiuteranno a determinare la vitalità cellulare.

Le cellule di lievito selvatiche in fase di log rappresentano cellule sane e normali e possono essere utilizzate per studiare gli organelli eucariotici, come il ribosoma. In questo video, puoi vedere il caricamento del lisiato cellulare dalle cellule raccolte in fase di log a un gradiente di saccarosio. Successivamente, le cellule vengono filate per sedimentare i ribosomi e viene utilizzato un monitor di assorbanza per generare il profilo ribosomi.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'allevamento e al mantenimento di Saccharomyces cerevisiae. In questo video abbiamo esaminato la curva di crescita del lievito, dimostrato come coltivare colture cellulari e mostrato come mantenere i ceppi di lievito. Grazie per aver guardato e non dimenticare di raccomandare questo video a un bocciolo.