Manutenção de leveduras

As importantes descobertas da regulação do ciclo celular, da atividade telomerase e da autofagia em Saccharomyces cerevisiae,provaram que esta espécie de levedura é um valioso organismo modelo para a pesquisa. Leveduras são fáceis de cultivar e plasmídeos de levedura e cepas estão disponíveis comercialmente. Apesar dos requisitos relativamente baratos para a colheita da levedura, a manutenção deste organismo é fundamental para experimentos bem sucedidos. Este vídeo lhe dará uma visão interna de como cultivar culturas de células de levedura e manter cepas de S. cerevisiae em laboratórios.

Na biologia, as curvas de crescimento representam a mudança na população celular ao longo de um período de tempo. Na levedura, a curva de crescimento é gerada pela traçação da densidade óptica, ou "OD", da cultura celular a 600 nm no eixo y e tempo no eixo x. Densidade óptica ou "absorvância" é a razão logarítmica da intensidade da luz que entra na suspensão da célula de levedura à intensidade que passa por ela. O OD em um comprimento de onda específico de luz é medido usando um espectrofotômetro.

Ao trabalhar com levedura, a curva de crescimento da linhagem de levedura deve ser gerada tomando medidas de OD em diferentes intervalos de tempo. A curva de crescimento da levedura é dividida em três fases principais: lag, logarítmica e fase estacionária. Durante a fase de defasagem, as células estão se aclimatando ao ambiente e estão crescendo em tamanho, mas não estão se dividindo. Em fase de registro, as células estão se dividindo ativamente, levando à duplicação celular. Uma vez que os nutrientes disponíveis são esgotados, as células de levedura entram em fase estacionária, onde a divisão celular desacelera e a população celular permanece constante.

Usando a curva de crescimento, o tempo de duplicação da cepa pode ser calculado com a seguinte equação: OD1 e OD2 representam medições de densidade óptica, e T1 e T2 são o tempo entre as medições. O tempo de duplicação é definido como o tempo necessário para que uma população celular dobre no número celular. Calcule entre dois valores de OD de fase de registro, por exemplo, entre os valores 0,2 e 0,5, conforme mostrado aqui. Leveduras tipo selvagem devem dar um valor de tempo duplicado de aproximadamente 90 minutos.

Saber o tempo de duplicação é benéfico, pois permitirá que você planeje seus experimentos de acordo ao longo do dia.

Agora que cobrimos as porcas e parafusos da curva de crescimento da levedura, vamos progredir para o laboratório e fazer algumas mãos na preparação para cultivar células de levedura. Os principais componentes da rica mídia de crescimento - também conhecido como alimentos de levedura - são: extrato de levedura, peptone e uma fonte de açúcar. O extrato de levedura contém teor de células de levedura, excluindo a parede celular, e fornece aminoácidos, vitaminas, carboidratos e outros nutrientes necessários para o crescimento. Peptone é derivado de carne animal ou leite e é a principal fonte de aminoácidos na mídia de leveduras. Uma fonte de açúcar, tipicamente glicose, é adicionada à medida que fornece energia para as células em crescimento.

Depois de dissolver o extrato de levedura e peptone na água, esterilize a mistura usando uma autoclave. Para fazer placas de mídia de levedura, adicione ágar à mídia líquida e despeje a mistura em placas, permitindo que ela se solidifique à temperatura ambiente. Estas placas podem ser usadas quando se espalham para cultivar colônias de leveduras.

Agora que temos toda a nossa mídia preparada, como crescemos culturas dessas criaturas do zero? Em primeiro lugar, certifique-se de que todos os instrumentos, soluções e mídia sejam estéreis.

Em seguida, obtenha uma placa para listrar células de levedura. Não, não esse tipo de streaking! Streaking é o processo de espalhar culturas de levedura líquida na placa de ágar usando um instrumento estéril, como você vê aqui. Ao redor das "listras" colônias individuais se formarão, que são derivadas de uma única célula de levedura, que pode ser colhida, a fim de obter uma população genética pura de células de levedura. Uma vez que as placas estejam listradas, inverta a placa e coloque-a em uma incubadora de 30 °C por 2 a 3 dias. Esta é a temperatura ideal para o crescimento da levedura.

Uma vez formadas colônias, inocular as células de levedura em um pequeno volume de mídia de crescimento. Inocular aqui significa escolher uma única colônia e apresentá-la à mídia misturando-a brevemente. Incubar a cultura em um agitador ou rotador de 30 °C por 48 horas.

Para cultivar culturas maiores de células, primeiro verifique o OD600 da cultura de levedura de 2 dias usando um espectrofotômetro. Faça as diluições apropriadas para que o OD inicial seja aproximadamente 0.1-0.2. Depois de diluir as células, coloque o frasco em um agitador de 30 °C e cresça as células até o OD desejado.

A próxima lição importante depois de aprender a cultivar S. cerevisiae é como armazená-los para uso futuro. A levedura cultivada em placas pode ser armazenada a 4 °C até 3 meses. No entanto, se você quiser crescer uma cultura fresca, certifique-se de re-listrar as células em um prato fresco primeiro antes de inocular.

Para armazenar estoques de cepas de leveduras por longos períodos, aliquot as células em criovials contendo glicerol. As células podem então ser armazenadas a -80 °C, onde podem permanecer até vários anos.

Agora que você é um profissional quando se trata de células de levedura em crescimento, vamos dar uma olhada em como podemos aplicar essas técnicas essenciais em pesquisa científica. Células na fase estacionária podem ser usadas para estudar genes que regulam a instabilidade do DNA do genoma durante o envelhecimento. Este vídeo mostra a coleção de células de uma cultura de três dias atrás. Eles são banhados em mídia seletiva que impede o crescimento de células normais de levedura. Apenas células que adquiriram uma mutação podem formar colônias nessas placas. O número de colônias nas placas é proporcional ao nível de instabilidade genômica na cultura.

Outro exemplo de estudo do envelhecimento é analisando a vida cronológica das células de levedura. O envelhecimento cronológico denota a perda de viabilidade celular durante um período de tempo e pode ser estudado pelo crescimento de culturas líquidas como mostrado aqui. Neste vídeo, o cientista está carregando várias culturas na especificação a fim de gerar curvas de crescimento, o que ajudará a determinar a viabilidade celular.

As células de levedura silvestres na fase de registro representam células saudáveis e normais e podem ser usadas para estudar organelas eucarióticas, como o ribossomo. Neste vídeo, você pode ver o carregamento do lysate celular de células coletadas em fase de registro para um gradiente de sacarose. Em seguida, as células são giradas para ribossomos de sedimentos e um monitor de absorção é usado para gerar o perfil ribossomo.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à criação e manutenção de Saccharomyces cerevisiae. Neste vídeo, revisamos a curva de crescimento da levedura, demonstramos como cultivar culturas celulares e mostramos como manter as cepas de levedura. Obrigado por assistir, e não se esqueça de recomendar este vídeo para um broto.