Mantenimiento de C. elegans

Correcto cuidado y mantenimiento de Caenorhabditis elegans es esencial para los experimentos exitosos.

Requieren muy poco espacio, son baratos a casa, tienen alta fecundidad y son fáciles de manipular. Pero sólo porque son sencillas para todo no significa ciencia wimpy. De hecho, Sydney Brenner llamó C. elegans &quo; regalo de la naturaleza a la ciencia, &quo; y desde su introducción en 1974 el gusano ha aparecido en un número de premio Nobel ganador experimentos.

En este video demostramos métodos básicos para el mantenimiento de C. elegans en el laboratorio, incluyendo: vivienda y alimentación, manejo, así como la congelación y descongelación de gusanos.

En la naturaleza, C. elegans se encontró en el suelo y alimentarse de materia vegetal en descomposición. En el laboratorio, es importante tener nematodos tan feliz como sea posible, y tan de la casa y alimentarlos con métodos muy específicos.

C. elegans puede ser crecido en 16, 20 o 25 ° C dependiendo de los requisitos del experimento, y o bien cultivarse sólido o en medios líquidos. En ambos casos se alimentan OP50, una cepa estandarizada de e. coli utilizada específicamente para la cultura Nematoda en cada laboratorio del gusano del mundo.

Cuando se cultiva a 25 ° C, C. elegans complete su ciclo de vida 2.1 veces más rápido que cuando crecido a 16 ° C. Un ciclo de vida más rápido significa que los gusanos maduran más rápidos, endecha huevos más y consuman más alimentos. Si los gusanos se les permite morir de hambre o ser demasiado lleno de gente entran en un estado larvario llamado la etapa de dauer. Las larvas de Dauer son resistentes al estrés y no envejecen.

Cuando se mantiene en medio sólido, C. elegans se cultivan en placas de agar con NGM medios o medios de cultivo de nematodos. El día antes de hacer placas, inocular medio LB líquido con una sola Colonia de OP50 E. coli. Incubar los medios a 37 ° C durante la noche con agitación.

Medios sólidos, medida y las cantidades adecuadas de estos ingredientes se combinan con agua desionizada en un matraz Erlenmeyer.

Después de la esterilización en autoclave durante al menos 15 minutos, deje enfriar el agar hasta 55 ° C en un baño de agua. Una vez que los medios de comunicación se enfríe a 55 ° C debe ser capaz de sostener cómodamente el recipiente de vidrio con las manos desnudas. Utilizando una técnica aséptica adecuada, aditivos como medicamentos o antibióticos pueden añadirse en este momento. Agite para mezclar. Entonces, pipetear NGM fundido en placas de Petri hasta que queden 2/3 completo. Deje las placas recién hechas secar en el Banco durante la noche.

A la mañana siguiente pellets OP50 a 3500 x g durante 10 minutos y luego resuspender las bacterias en medio LB a una concentración de X 10. Ahora, pipetear un césped central en cada plato. Evite tocar la punta de la pipeta a la superficie de la NGM y tenga cuidado de no permitir que la cultura que toque las paredes de la placa. Dejar las placas se sequen en el Banco durante la noche. Una vez seco, exponer las placas a la luz UV para esterilizarlas. Ahora están listos para ser usados cuando el cultivo de lombrices.

C. elegans son manipulados individualmente utilizando una herramienta conocida como el pico de gusano. La selección es por lo general se hace de 30 calibre 90% platino y 10% iridio hilo, aunque algunos investigadores prefieren ligeramente diferentes composiciones de metal. Para hacer una selección, empezar por romper la punta de una pipeta de Pasteur a la longitud preferida.

Cortar unos 3 a 4 cm de alambre y coloque 0.5 cm de la misma dentro de la punta de la pipeta. Sellar el cable con el vidrio sobre un mechero de Bunsen. La longitud del alambre que sobresale del cristal es de unos 3 a 3.5 cm pero puede variar según las preferencias individuales.

Aplanar el extremo del alambre con un borde duro. Luego doblar la parte aplanada hacia arriba para formar una bola. Por último, lije los bordes de la hoja para evitar dañar el gusano o el agar.

A recoger gusanos esterilización el alambre de la hoja de una llama. Luego cubra la punta con grueso, pegajoso OP50 Escherichia coli de una placa NGM. Tenga cuidado de no perfore o cicatriz de la superficie del agar.

Mientras mira a través de un alcance de disección, sacar ligeramente el gusano en el pico aplanado, pegajoso hasta que el gusano se adhiere a la selección.

Una vez que el gusano está en la selección, transferencia inmediatamente ligeramente manteniendo la punta a la nueva superficie de una placa nueva y deslice sobre el césped bacteriano. El gusano debe arrastrarse fuera de la selección. El gusano no debe permanecer en la selección durante demasiado tiempo o puede secar.

Una de las razones por las C. elegans es un modelo popular para la investigación es porque las culturas se pueden almacenar por largos períodos de tiempo sin efectos adversos.

En primer lugar, larvas de lavado recién muerto de hambre con 0,5 ml Buffer M9, agitar suavemente para aflojar todos los animales adultos y larva y luego transferirse a una criotubo microcentrífuga. Luego, añadir igual cantidad 30% de glicerol en Buffer M9. Finalmente, embale el frasco en una caja aislada y conservar a-80 ° C.

Para recuperar los gusanos, retire el tubo de un congelador de-80 y dejar descongelar a temperatura ambiente hasta que el contenido completo del derretimiento. Pipeta el líquido en un plato fresco de NGM con césped OP50 e incubar a 20 ° C. Después de 2-3 días, transferir 10-15 animales a una nueva placa y que puedan reproducirse de una generación. Recoger la progenie y la puntuación para corregir fenotipos.

Ahora que hemos visto cómo C. elegans se mantiene en el laboratorio, vamos a echar un vistazo a como alimentación, vivienda y el manejo de las condiciones se modifican para experimentos.

El Premio Nobel ganador descubrimiento de interferencia del ARN permitió investigadores silenciar cualquier gen C. elegans para determinar su función.

Podemos inducir RNAi en la C. elegans por primeras placas preparación con e. coli que expresan objetivo gene dsRNA, que comen los gusanos.

4 º estado larvario gusanos se transfiere a las placas de RNAi y permitió a poner huevos. En el escenario deseado de desarrollo de la progenie se recogen y se anotó para fenotipos. Puesto que compartimos alrededor de la mitad de nuestro genoma con el gusano muchas de las ideas obtenidas son aplicables a enfermedades humanas.

Debido a su rápido ciclo de vida, C. elegans es particularmente idóneo como un modelo de envejecimiento.

En primer lugar, se genera una población tiempo-sincronizado de C. elegans , al permitir que adultos hermafroditas desovar en las placas de NGM. Los gusanos ponen huevos durante 6-8 h y luego se retiran.

Cuando los gusanos se encuentran en la etapa deseada ellos son transferidos a nuevas placas, NGM con ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana y FUDR para evitar la reproducción.

Desde este punto hacia adelante los gusanos adultos se observan cada 2-3 días hasta que los gusanos han muerto. Gusanos muertos se retiran de la placa y se registró el número de gusanos vivos y muertos.

Análisis de vida útil en el contexto de insultos genéticos o ambientales pueden producir conocimientos significativos en el proceso de envejecimiento.

Con láseres es posible realizar el corte de los axones individuales, o axotomies en C. elegans para estudiar cómo regenerar las células nerviosas.

Sin embargo, porque los gusanos nunca quedarse quieto, se colocan sobre soportes de agarosa de 10% en solución de microesferas. Se coloca un cubreobjetos encima. Las microesferas aumentan el coeficiente de fricción de la interacción de pad-cubreobjetos, efectivamente el gusano en lugar de congelación.

La diapositiva ahora se prepara para realizar axotomies. Las neuronas son traídas a la vista y centradas en el microscopio. El láser se dispara entonces usando el pedal. Óptima energía separa la neurona sin dañar las estructuras adyacentes. Se cortan tantos axones posible por animal.

Con cuidado luego se extraiga la almohadilla de la agarosa de la diapositiva, y gusanos pueden recuperar en una placa NGM sembrada a 20 ° C. Entre 8-48 horas después de la axotomía, las neuronas pueden prepararse para anotar para la regeneración. En la parte distal del corte, la neurona forma un tronco. Sin embargo, en la porción proximal la neurona regenera formando neurites alargados.

Sólo ha visto de Zeus tomar en Ceanorhabditis elegans mantenimiento básico. En este video repasamos: vivienda y alimentación de C. elegans, manipularlos y congelación y recuperación de los nematodos.

También tomamos un breve recorrido por algunas aplicaciones que C. elegans una herramienta tan potente. Aunque C. elegans son diferentes a los mamíferos en muchos aspectos, su composición genética similar, facilidad de mantenimiento y manipulación simple les hacen un modelo importante en la búsqueda de la comprensión de la enfermedad y la biología mamífero. ¡Gracias por ver!