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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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예쁜 꼬마 선충 유지

Overview

Ceanorhabditis elegans는, 아직도, 발달, 유전, 분자 및 물리적 현상의 각종 공부를 위한 모형 유기체로 큰 성공을 위해 이용되었습니다. C. elegans를 최대한 의전으로 사용하기 위해서는 이 강력한 유기체의 기본적인 유지 보수에 대한 적절한 관심과 주의가 필수적입니다.

이 비디오에서는 C. elegans의기본 하우징 및 공급 요구 사항, 웜 픽을 사용하여 웜을 올바르게 처리하고 조작하는 방법 및 중요한 웜 스톡을 동결하고 복구하는 방법을 배웁니다. 비디오의 끝으로 우리는 주택을 수정의 몇 가지 응용 프로그램을 방문합니다, 먹이및 이러한 중요한 동물의 조작.

Procedure

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성공적인 실험을 위해서는 Caenorhabditis elegans의 올바른 관리 및 유지 보수가 필수적입니다.

그들은 아주 작은 공간을 필요로하고, 집에 싸고, 높은 fecundity를 가지고 있으며, 조작하기 쉽습니다. 그러나 그들이 주변에 유지하는 것이 간단하다고 해서 위프 과학을 의미하지는 않습니다. 사실 시드니 브레너는 C. 엘레간을 "과학에 대한 자연의 선물"이라고 불렀으며, 1974년에 도입된 이래로 이 벌레는 노벨상을 수상한 여러 실험에 등장했습니다.

이 비디오에서는 하우징 및 수유, 취급, 벌레의 동결 및 해동을 포함하여 실험실에서 C. elegans를 유지하는 기본 방법을 시연할 것입니다.

야생에서 C. 예인은 토양에서 발견되며 분해 된 식물 물질에 먹이를 주습니다. 실험실에서는 선충을 가능한 한 행복하게 유지하는 것이 중요하며, 그래서 우리는 매우 구체적인 방법을 사용하여 집에 먹이십시오.

C. 예르간은 실험의 요구 사항에 따라 16, 20 또는 25 °C에서 재배 될 수 있으며 고체 또는 액체 매체에서 재배 될 수 있습니다. 두 경우 모두 OP50을 공급하며, 전 세계 모든 벌레 실험실에서 선충 배양에 특별히 사용되는 대장균의 표준화된 균주입니다.

25°C에서 재배하면 C. elegans가 16°C에서 재배할 때보다 2.1배 더 빨리 수명 주기를 완료합니다. 수명 주기가 빨라지면 벌레가 더 빨리 성숙하고, 더 많은 알을 낳고, 더 많은 음식을 섭취한다는 것을 의미합니다. 벌레가 굶어 굶주리거나 너무 혼잡하게 되면 그들은 dauer 무대라는 애벌레 무대에 들어갑니다. Dauer 애벌레는 스트레스에 강하고 나이가 들어가지 않습니다.

단단한 매체에서 유지되면, C. elegans는 선충 성장 미디어 또는 NGM 미디어로 준비 된 천 접시에 재배됩니다. 플레이트를 만들기 전날, OP50 대장균의 단일 콜로니콜로 액체 LB 미디어를 접종. 밤새 37°C에서 미디어를 흔들어 보배합니다.

견고한 미디어를 만들려면 적절한 양의 재료를 에렌마이어 플라스크의 탈이온된 물과 측정하고 결합합니다.

적어도 15 분 동안 오토클레이브 한 후, 수조에서 55 °C로 냉각하십시오. 미디어가 55°C로 냉각되면 맨손으로 유리 용기를 편안하게 잡을 수 있어야 합니다. 적절한 무균 기술을 사용하여 약물이나 항생제와 같은 첨가제를 이 시기에 첨가할 수 있습니다. 혼합 소용돌이. 그런 다음 파이펫이 2/3 가득 찰 때까지 페트리 플레이트에 NGM을 용융합니다. 새로 만든 접시가 하룻밤 동안 벤치에서 건조하게하십시오.

다음날 아침 OP50은 3500 x g에서 10분 동안 펠릿을 한 다음 LB 매체의 박테리아를 10배 농도로 재보페합니다. 이제 중앙 잔디밭을 각 접시에 파이펫으로 바치게 됩니다. NGM의 표면에 파이프 팁을 터치하지 말고 문화가 플레이트 벽을 만지지 않도록주의하십시오. 하룻밤 동안 벤치에 접시를 말리십시오. 일단 건조되면, 그들을 살균하기 위해 UV 빛에 접시를 노출. 그들은 이제 벌레를 배양 할 때 사용할 준비가되어 있습니다.

C. elegans는 웜 픽으로 알려진 도구를 사용하여 개별적으로 조작됩니다. 선택은 일반적으로 30 게이지 90 % 백금과 10 % 이리듐 와이어로 만들어지지만 일부 연구자들은 약간 다른 금속 조성물을 선호 할 수 있습니다. 픽을 만들려면 파스퇴르 파이펫 끝을 선호하는 길이로 나누기 시작합니다.

와이어의 약 3 ~4cm를 잘라 파이프의 끝 안쪽에 그것의 0.5 cm를 놓습니다. 번센 버너 위에 와이어를 유리에 밀봉합니다. 유리에서 튀어나온 와이어의 길이는 약 3~3.5cm이지만 개별 선호도에 따라 달라질 수 있다.

하드 엣지를 사용하여 와이어 의 끝을 평평하게 합니다. 그런 다음 평평한 부분을 위쪽으로 구부려 스쿱을 형성합니다. 마지막으로, 웜이나 한천이 손상되지 않도록 선택한 가장자리의 모래를 비우게 됩니다.

벌레를 선택하려면 화염에 픽의 와이어를 살균. 그런 다음 NGM 플레이트에서 두껍고 끈적끈적한 OP50 대장균으로 팁을 코팅합니다. 천 표면에 구멍을 뚫거나 흉터하지 않도록주의를 사용합니다.

해부 범위를 살펴보면 웜이 픽에 달라붙을 때까지 평평하고 끈적끈적한 선택으로 웜을 가볍게 떠올보세요.

웜이 선택되면 팁을 새 판의 새 표면으로 가볍게 잡고 세균 잔디밭을 가로질러 미끄러지면 즉시 전달합니다. 웜은 선택에서 크롤링해야 합니다. 벌레는 너무 오랫동안 선택에 머물러서는 안되며 건조 할 수 있습니다.

C. elegans가 연구를 위한 인기 있는 모델인 이유 중 하나는 문화권이 부작용 없이 장기간 보관할 수 있기 때문입니다.

먼저, 0.5ml M9 버퍼를 사용하여 갓 굶주린 애벌레를 씻고 부드럽게 소용돌이쳐 모든 애벌레와 성인 동물을 풀어준 다음 마이크로 센테리퍼기 또는 냉동튜브로 옮겨냅니다. 그런 다음 M9 버퍼에 동일한 양의 30 % 글리세롤을 추가하십시오. 마지막으로 유리병을 절연 된 상자에 포장하고 -80 ° C에 보관하십시오.

웜을 복구하려면 -80 냉동고에서 튜브를 제거하고 내용기가 완전히 녹을 때까지 실온에서 해동하십시오. OP50 잔디와 신선한 NGM 플레이트에 액체를 피펫과 20 °C에서 배양. 2-3 일 후, 새로운 접시에 10-15 동물을 전송하고 그들이 한 세대에 대한 재현 할 수 있습니다. 올바른 표현형을 위해 자손과 점수를 수집합니다.

이제 C. elegans가 실험실에서 어떻게 유지되는지 보았기 때문에 실험을 위해 공급, 하우징 및 처리 조건이 어떻게 수정되는지 살펴보겠습니다.

RNA 간섭의 노벨상 수상 발견은 연구원이 그것의 기능을 결정하기 위하여 어떤 C. elegans 유전자든지 침묵하는 것을 허용했습니다.

우리는 벌레가 먹을 표적 유전자 dsRNA를 표현하는 대장균을 가진 플레이트를 첫째로 준비해서 C. elegans에 있는 RNAi를 유도할 수 있습니다.

그런 다음 4 번째 애벌레 단계 벌레는 RNAi 접시로 옮겨지고 알을 낳을 수 있습니다. 개발의 바람직한 단계에서 자손은 수집 및 표현형에 대한 점수. 우리는 벌레와 우리의 게놈의 대략 반을 공유하기 때문에 수집한 통찰력의 많은 인간적인 질병에 적용됩니다.

빠른 수명 주기 때문에 C. elegans는 노화의 모델로 특히 적합합니다.

첫째, 성인 헤르마프로디테족이 NGM 플레이트에 알을 낳을 수 있도록 함으로써 C. elegans의 시간 동기화 된 인구가 생성됩니다. 벌레는 6-8 시간 동안 계란을 낳은 다음 제거됩니다.

벌레가 원하는 단계에 있을 때 세균 오염을 방지하기 위해 암피실린을 함유한 새로운 NGM 플레이트로 옮겨져 생식을 방지합니다.

이 시점부터 모든 벌레가 죽을 때까지 성인 벌레는 2-3 일마다 관찰됩니다. 죽은 벌레는 접시에서 제거되고 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수가 기록됩니다.

유전적 또는 환경적 모욕의 맥락에서 수명을 분석하면 노화 과정에 대한 상당한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

레이저를 사용하면 신경 세포가 어떻게 재생되는지 연구하기 위해 살아있는 C. elegans에서 축축또는 개별 축삭절단을 수행 할 수 있습니다.

그러나 벌레는 결코 가만히 있기 때문에 마이크로 비드용10 % 아가로즈 패드에 배치됩니다. 커버 슬립이 위에 놓입니다. 마이크로비드는 패드 커버슬립 상호 작용의 마찰 계수를 증가시켜 벌레를 효과적으로 동결시합니다.

이제 슬라이드는 축축절을 수행할 준비가 되었습니다. 뉴런은 현미경을 중심으로 시야에 들어갑니다. 레이저는 발 페달을 사용하여 발사됩니다. 최적의 레이저 전력은 인접한 구조물에 해를 끼치지 않고 뉴런을 절속시합니다. 가능한 한 많은 축축이 동물 당 절단됩니다.

아가로즈 패드는 슬라이드에서 조심스럽게 제거되고, 벌레는 20°C에서 시드 NGM 플레이트에서 복구할 수 있다. 축 축 절제술 후 8-48 시간 사이, 뉴런은 재생을 위해 득점 할 준비가되어 있습니다. 절단의 말단 부분에서, 뉴런은 그루터기를 형성한다. 그러나, 근위 부에서 뉴런은 길쭉한 중성염을 형성하여 재생한다.

당신은 단지 기본 Ceanorhabditis elegans 유지 보수에 조브의 걸릴 보았다. 이 비디오에서 우리는 검토 : C. elegans의 주택과 먹이, 처리, 선충의 동결 및 복구.

우리는 또한 C. elegans를 강력한 연구 도구로 만드는 몇 가지 응용 프로그램을 통해 간단한 투어를했다. C. elegans는 여러 가지 면에서 포유류와 유사하지만, 유사한 유전 적 메이크업, 유지 보수의 용이성 및 간단한 조작은 포유류 생물학 및 질병을 이해하는 탐구에서 중요한 모델입니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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