C. elegans Manutenção

O cuidado correto e a manutenção dos elegans de Caenorhabditis são essenciais para experiências bem sucedidas.

Eles exigem muito pouco espaço, são baratos para casa, têm alta fecundidade, e são fáceis de manipular. Mas só porque eles são simples de manter por perto não significa ciência covarde. Na verdade, Sydney Brenner famosamente chamou C. elegans de "presente da natureza para a ciência", e desde sua introdução em 1974 o verme tem sido destaque em uma série de experimentos ganhadores do Prêmio Nobel.

Neste vídeo, demonstraremos métodos básicos para manter C. elegans no laboratório, incluindo: habitação e alimentação, manuseio, bem como congelamento e descongelamento de vermes.

Na natureza, C. elegans são encontrados no solo e se alimentam de matéria vegetal em decomposição. No laboratório, é importante manter nematoides o mais felizes possível, e assim nós casamos e os alimentamos usando métodos muito específicos.

C. elegans podem ser cultivados a 16, 20 ou 25 °C, dependendo dos requisitos do experimento, e podem ser cultivados em mídia sólida ou líquida. Em ambos os casos eles são alimentados OP50, uma cepa padronizada de E. coli usada especificamente para a cultura nematode em todos os laboratórios de vermes ao redor do mundo.

Quando cultivados a 25 °C, c. elegans completam seu ciclo de vida 2,1 vezes mais rápido do que quando cultivado a 16 °C. Um ciclo de vida mais rápido significa que os vermes amadurecem mais rápido, colocam mais ovos e consomem mais alimentos. Se os vermes podem morrer de fome ou ficar muito lotados, eles entram em um estágio larval chamado o estágio dauer. Larvas dauer são resistentes ao estresse e não envelhecem.

Quando mantidos em mídia sólida, C. elegans são cultivados em placas de ágar preparadas com mídia de crescimento nematode ou mídia NGM. Um dia antes de fazer placas, inoculado mídia lb líquido com uma única colônia de OP50 E. coli. Incubar a mídia a 37 °C durante a noite com agitação.

Para fazer mídia sólida, meça e combine as quantidades apropriadas desses ingredientes com água deionizada em um frasco de Erlenmeyer.

Depois de autoclaving por pelo menos 15 minutos, deixe o ágar esfriar a 55 °C em um banho de água. Uma vez que a mídia tenha esfriado a 55 °C, você deve ser capaz de segurar confortavelmente o recipiente de vidro com as mãos nuas. Usando técnica asséptica adequada, aditivos como drogas ou antibióticos podem ser adicionados neste momento. Redemoinho para misturar. Em seguida, pipeta fundida NGM em placas de Petri até que estejam 2/3 cheias. Deixe as placas recém-feitas secarem no banco durante a noite.

Na manhã seguinte, pelota o OP50 a 3500 x g por 10 minutos e, em seguida, resuspende a bactéria em mídia LB para uma concentração de 10X. Agora, pipeta um gramado central em cada prato. Evite tocar na ponta da tubulação na superfície do NGM e tome cuidado para não permitir que a cultura toque nas paredes da placa. Deixe as placas secarem no banco durante a noite. Uma vez seco, exponha as placas à luz UV para esterilizá-las. Eles estão agora prontos para serem usados quando os vermes.

C. elegans são manipulados individualmente usando uma ferramenta conhecida como a picareta de vermes. A picareta é tipicamente feita de 30 bitola 90% de platina e 10% de fio de irídio, embora alguns pesquisadores possam preferir composições metálicas ligeiramente diferentes. Para fazer uma escolha, comece quebrando a ponta de uma tubulação Pasteur para o comprimento preferido.

Corte cerca de 3 a 4 cm de arame e coloque 0,5 cm dele dentro da ponta da tubulação. Sele o fio no vidro sobre um queimador Bunsen. O comprimento do fio saliente do vidro é de cerca de 3 a 3,5 cm, mas pode variar de acordo com as preferências individuais.

Achate a extremidade do fio usando uma borda dura. Em seguida, dobre a porção achatada para cima para formar uma colher. Finalmente, lixe as bordas da picareta para evitar danificar o verme ou o ágar.

Para colher vermes esterilizar o fio da pega em uma chama. Em seguida, cubra a ponta com op50 E. coli grossa e pegajosa a partir de uma placa NGM. Use o cuidado para não perfurar ou cicatrizar a superfície do ágar.

Enquanto olha através de um escopo de dissecção, levemente colher o verme no achatado, pegajoso até que o verme grude na escolha.

Uma vez que o verme esteja na picareta, transfira imediatamente segurando levemente a ponta para a nova superfície de uma nova placa e deslizando-a através do gramado bacteriano. O verme deve rastejar para fora da picareta. O verme não deve ficar na picareta por muito tempo ou pode secar.

Uma das razões pelas quais C. elegans é um modelo popular para a pesquisa é porque as culturas podem ser armazenadas por longos períodos de tempo sem qualquer efeito adverso.

Primeiro, lave larvas recém-famintas usando tampão M9 de 0,5 ml, gire suavemente para soltar todas as larvas e animais adultos e, em seguida, transfira para um microcentrifuge ou criotube. Em seguida, adicione a quantidade igual de 30% de glicerol no Buffer M9. Por fim, embale o frasco em uma caixa isolada e armazene a -80 °C.

Para recuperar os vermes, remova o tubo de um congelador -80 e deixe descongelar à temperatura ambiente até que o conteúdo derreta completamente. Pipete o líquido em uma placa NGM fresca com gramado OP50 e incubar a 20 °C. Após 2-3 dias, transfira 10-15 animais para uma nova placa e permita que eles se reproduzam por uma geração. Colete a descendência e marque para fenótipos corretos.

Agora que vimos como C. elegans é mantido no laboratório, vamos dar uma olhada em como as condições de alimentação, habitação e manuseio são modificadas para experimentos.

A descoberta vencedora do Nobel da interferência do RNA permitiu que os pesquisadores silenciem qualquer gene C. elegans, a fim de determinar sua função.

Podemos induzir RNAi em C. elegans preparando primeiro placas com E. coli que expressam gene dsRNA, que os vermes vão comer.

Em seguida, vermes de estágio 4 são transferidos para as placas RNAi e autorizados a colocar ovos. Na fase desejada de desenvolvimento, a prole é coletada e pontuada para fenótipos. Uma vez que compartilhamos cerca de metade do nosso genoma com o verme muitos dos insights obtidos são aplicáveis à doença humana.

Por causa de seu ciclo de vida rápido, C. elegans é particularmente adequado como um modelo de envelhecimento.

Primeiro, uma população sincronizada de C. elegans é gerada, permitindo que hermafroditas adultas coloquem ovos em placas de NGM. Os vermes colocam ovos por 6-8 horas e depois são removidos.

Quando os vermes estão na fase desejada, são transferidos para novas placas de NGM contendo ampicillina para evitar contaminação bacteriana e FUDR para evitar a reprodução.

A partir deste ponto, vermes adultos são observados a cada 2-3 dias até que todos os vermes tenham morrido. Vermes mortos são removidos da placa e o número de vermes vivos e mortos são registrados.

Analisar o tempo de vida no contexto de insultos genéticos ou ambientais pode produzir insights significativos sobre o processo de envelhecimento.

Usando lasers é possível realizar axotomias ou o corte de axônios individuais, em C. elegans vivos para estudar como as células nervosas se regeneram.

Mas, como os vermes nunca ficam parados, eles são colocados em almofadas 10% agarose em solução de microesferas. Um deslizamento de cobertura é colocado em cima. As microesferas aumentam o coeficiente de atrito da interação pad-coverslip, efetivamente congelando o verme no lugar.

O slide está preparado para realizar axotomias. Os neurônios são trazidos à vista e centrados no microscópio. O laser é então disparado usando o pedal do pé. A potência laser ideal cortará o neurônio sem prejudicar as estruturas adjacentes. O maior número possível de axônios são cortados por animal.

A almofada de agarose é então cuidadosamente removida do slide, e os vermes são autorizados a se recuperar em uma placa de NGM semeada a 20 °C. Entre 8-48 horas após a axotomia, os neurônios podem estar preparados para pontuar para a regeneração. Na parte distal do corte, o neurônio forma um toco. No entanto, na porção proximal o neurônio se regenera formando neurites alongados.

Você acabou de ver a visão do JoVE sobre a manutenção básica da Ceanorhabditis Elegans. Neste vídeo revisamos: habitação e alimentação de C. elegans, manuseio deles, congelamento e recuperação de nematoides.

Também fizemos um breve tour por alguns aplicativos que fazem de C. elegans uma ferramenta de pesquisa tão poderosa. Embora C. elegans sejam diferentes dos mamíferos em muitos aspectos, sua composição genética semelhante, facilidade de manutenção e manipulação simples fazem deles um modelo importante na busca pela compreensão da biologia e da doença dos mamíferos. Obrigado por assistir!