Utilisation d'ARN interférent chez Caenorhabditis elegans

L’interférence par ARN, ou ARNi, est une technique largement utilisée dans laquelle un ARN double brin est introduit dans un organisme, entrainant l’inactivation d’un gène cible. La découverte de l’interférence par ARN, récompensée par un prix Nobel, a permis aux chercheurs d’inhiber chaque gène de C. elegans afin de déterminer sa fonction. L’ARNi peut être induit dans le C. elegans en préparant tout d’abord des plaques d’E. coli qui expriment le gène cible d’ARN double brin, E. coli qui seront ingérés par les vers. Des vers en 4ème étape larvaire sont ensuite transférés sur les plaques d’ARNi pour leur permettre de pondre. A l’étape désirée de développement, les descendants sont récoltés et leurs phénotypes évalués.

La technique d’ARNi est fréquemment utilisée chez le C. elegans pour effectuer des criblages de génétique inverse et des criblages automatisés à haut débit, ainsi que comme outil pour l’étude des processus de développement. Dans cette vidéo, nous allons présenter le concept de l'interférence par ARN, montrer comment utiliser la technique d’ARNi chez les C. elegans, (F1) et discuter de la façon dont les scientifiques utilisent l'ARNi comme outil pour mieux comprendre les processus biologiques communs. (F2)

Commençons d'abord par vous montrer comment fonctionne l'interférence par ARN. Dans le cas du C. elegans, les vers sont nourris de bactéries préalablement transformées avec des plasmides codant l'ARN double brin complémentaire du gène que vous souhaitez inhiber. Comme indiqué précédemment, les C. elegans se nourrissent de ces bactéries transformées. Suivant un mécanisme actuellement inconnu, une fois ingéré, l'ARN double brin s’intègre au tissu du C. elegans.

Une fois à l'intérieur de la cellule, l'enzyme éminceuse « Dicer » coupe l'ARN double brin en petit ARNi ou pARNi (small interfering RNA ou siRNA en anglais), comportant entre 21 et 23 nucléotides. Le pARNi s’associe ensuite avec le complexe d'inhibition induit par ARN ou complexe « RISC » (RNA- Induced Silencing Complex en anglais), et se déplie. Le complexe pARNi/RISC se lie alors à l'ARNm cible par appariement de bases complémentaires. Ceci conduit à la dégradation de l'ARNm et par conséquent à l'inhibition de ce gène.

Avant de commencer la procédure, les bactéries exprimant l'ARN double brin d'intérêt doivent être préparées. Des banques de données de bactéries qui répertorient les plasmides codant l'ARN double brin pour des milliers de gènes sont disponibles dans le commerce. Si ce n'est pas le cas, la séquence du gène cible doit être clonée en un plasmide suivant des techniques standard de clonage. Le plasmide contient un gène de résistance à l'antibiotique ampicilline, qui peut être utilisé pour sélectionner des colonies bactériennes contenant ce plasmide.

Ensuite, utilisez des techniques standard pour transformer le plasmide codant votre ARN double brin d'intérêt dans la souche de la bactérie d’E. coli « DE3 » qui exprimera cet ARN double brin. Transformez également des bactéries avec un plasmide vide en tant que témoin. Notez que la souche d’E. coli utilisée dans ces expériences n'a pas d’ARN polymérase III, car celle-ci {qui autrement} digérerait l'ARN double brin. Cette bactérie contient également un gène inductible par IPTG pour l’ADN polymérase T7, qui transcrit l'ARN double brin dans le plasmide. Enfin, les bactéries (DE3) sont résistantes à la fois à la tétracycline et à la carbénicilline, afin de maintenir l'expression de l’ARN polymérase III et empêcher la croissance de bactéries indésirables.

Etalez les bactéries transformées HT115 (DE3) sur des plaques de gélose LB contenant 12,5 μg/ml de tétracycline et 25 μg/ml de carbénicilline. Incubez pendant une nuit à 37 °C; les colonies bactériennes seront présentes sur les plaques le lendemain matin. Choisissez alors une seule colonie de bactéries, et ajoutez-la à 1 ml de milieu de culture LB contenant 100 μg/ml d'ampicilline afin de sélectionner les bactéries contenant le plasmide. Incubez pendant une nuit à 37 °C sous agitation. Après la nuit d’incubation, ajoutez 5 ml du milieu de culture LB contenant 100 μg/ml (microgramme/ml) d'ampicilline à la culture, et incubez encore 4 à 6 heures à 37 °C.

Une fois les bactéries prêtes, les plaques utilisées pour l'ARNi chez le ver doivent être préparées pour l’alimentation. Ces plaques contiennent de l'agar, de l'eau, de la carbénicilline, du mélange pour culture de vers, et l'IPTG pour activer l'ADN polymérase T7 dans les bactéries (ADN polymérase qui transcrit l'ARN double brin dans le plasmide). Ajoutez 0,5 ml de la culture de bactéries sur des plaques utilisées pour l'ARNi chez le ver et incubez pendant une nuit à 37 °C, créant ainsi un lit bactérien.

Avant l’ajout des vers aux plaques d'ARNi, il est important de synchroniser les étapes de développement du ver, de sorte que les différences de phénotypes observées ne soient pas un artefact de l’étape de développement. Afin de synchroniser les étapes de développement, stérilisez tout d'abord à la flamme un fil droit de platine.

Utilisez cet outil de prélèvement de vers pour ajouter les vers L4 à chaque plaque d’ARNi, et incubez une nuit à 20 °C, afin de permettre aux vers de devenir des jeunes adultes prêt à pondre. Transférez ensuite ces jeunes adultes sur de nouvelles plaques d’ARNi et incubez de 6 a 8 heures à 20 °C, période pendant laquelle les œufs sont pondus. Une fois que tous les adultes sont retirés, le développement des œufs sera synchronisé. Laissez enfin les vers grandir sur les plaques d’ARNi jusqu'à ce qu'ils atteignent l’étape de développement souhaitée pour l'analyse.

Afin d’observer les vers, une lame avec un tapis d’agar à 4% doit être préparée. Tout d'abord, collez deux lames de verre avec du scotch, créant ainsi des pièces d'espacements qui assurent une épaisseur de gélose uniforme. Placez une lame de verre propre entre ces deux pièces d'espacement et pipetez environ 150 μl de la solution liquide d’agar à 4% sur la lame. Couvrez rapidement la gélose liquide avec une lame perpendiculaire aux pièces d'espacements. Séparez délicatement les lames ; le tapis de gélose adhèrera sur l’une des lames.

Ajoutez ensuite 10 μl d'un anesthésique tel que l'azoture de sodium sur le tapis de gélose pour immobiliser les animaux. Avec un fil droit de platine, transférez les vers au tapis de gélose et couvrez d’une lamelle. Observez enfin les vers au microscope. Comparez les vers dont les gènes ont été inhibés par ARNi aux vers témoins, et notez les différences de taille, d’étape de développement, de morphologie, de localisations des protéines marquées par fluorescence, ainsi que d'autres phénotypes potentiels.

L’une des applications les plus utiles de l'interférence par ARN est la possibilité d'effectuer facilement des criblages par génétique inverse. Un criblage par génétique inverse est une approche permettant la découverte de la fonction de gènes par l'inhibition d'une série de gènes connus et l'évaluation des résultats phénotypiques. Par exemple, les chercheurs peuvent utiliser une banque de données de bactéries qui expriment l'ARN double brin pour presque tous les gènes du génome du C. elegans. Ces bactéries sont cultivées sur des plaques multi-puits puis données en nourriture aux vers. Les effets phénotypiques de l'inhibition par ARNi peuvent ainsi être évalués pour de nombreux gènes, donnant un aperçu des fonctions normales des gènes in vivo.

Les criblages génétiques automatisés sont un type de criblage par génétique inverse à extrêmement haut débit. Dans ces criblages génétiques automatisés, l'ensemble du génome de C. elegans peut être inhibé très facilement en manipulant à l'aide de robots des milliers de clones bactériens, et en utilisant des instruments spécialisés pour l'analyse quantitative.

Par exemple, des vers exprimant un marqueur fluorescent transgénique / pour le gène peptide antimicrobien nlp 29, sont soumis à l'inhibition par ARNi de milliers de gènes /par l’intermédiaire de l’alimentation des bactéries. Au même moment, les vers sont mis en contact avec des spores fongiques. La réponse du peptide antimicrobien au champignon peut ainsi être évaluée.

Le développement des C. elegans est souvent étudié grâce à l'ARNi. Les scientifiques peuvent utiliser l'interférence par ARN pour inhiber n'importe quel gène (ou ensemble de gènes) d'intérêt, et évaluer exactement comment ce gène affecte les processus de développement et/ou la durée du développement. Par exemple, l'inhibition par ARNi peut révéler les gènes qui retardent le développement lorsqu'ils sont inhibés, ou les gènes impliqués dans le développement des organes.

Vous venez de regarder l'introduction de JOVE à l'interférence par ARN chez le C. elegans. Nous avons présenté le fonctionnement de l'interférence par ARN ainsi que l’utilisation de l'interférence par ARN chez le C. elegans via l'alimentation bactérienne. L'interférence par ARN est un outil précieux pour les criblages par génétique inverse comprenant les criblages automatisés à haut débit ; il est aussi un outil utile pour les études du développement. Merci de votre attention!