Summary
Overview
Die RNA Interferenz ist eine häufig verwendete Methode, in welcher doppelsträngige RNA von außerhalb in einen Organismus eingefügt wird, um dadurch die Abschaltung eines Zielgens zu bewirken. In dem Fadenwurm C. elegans ist die RNAi Methode besonders einfach und effektiv, weil diese die RNAi einfach durch Bakterien, welche die doppelsträngige RNA (dsRNA) exprimieren, die komplementär zu dem Zielgen ist, mit ihrer Nahrung aufnehmen können.
Zuerst behandelt das Video die Grundlagen der RNA Interferenz und erklärt weshalb es zur Genabschaltung kommt. Dann zeigen wir ein Protokoll, um RNAi in C. elegans zu benutzen, welches die Vorbereitung von Bakterien und RNAi Wurm-Platten, das Kultivieren der Würmer, und Experimente wie man die Effekte der RNAi misst, beinhaltet. Die RNAi wird oft für umgekehrt genetische Screens benutzt, um zu erforschen welche Gene für bestimmte biologische Funktionen wichtig sind. Automatisierte, umgekehrt genetische Screens ermöglichen eine effiziente Abschaltung für die Analyse von einer großen Anzahl von Genen. Die RNAi wird auch oft benutzt, um die Entwicklung von C. elegans besser zu verstehen. Seit der Entdeckung von RNAi, ist sie von vielen Forschen verwendet worden, um biologische Phänomene besser zu verstehen.
Procedure
Die RNA Interferenz, oder RNAi, ist eine häufig angewandte Methode in welcher doppelsträngige RNA in einen Organismus eingefügt wird, um zielgerichtet ein Gen abzuschalten. Die nobelpreisgewinnende Entdeckung der RNA Interferenz hat es Wissenschaftlern ermöglicht jedes C. elegans Gen abzuschalten, um dessen Funktion zu bestimmten. RNAi kann in C. elegans eingefügt werden, indem man Platten mit E. coli benetzt, welche die dsRNA des Zielgens exprimieren, und welche dann von dem Wurm gegessen werden. Dann transferiert man Würmer in dem 4. Larvenstadium auf die RNAi Platten und lässt sie Eier legen. Bei dem gewünschten Entwicklungsstadium sammelt man dann die Nachkommen ein und untersucht sie auf einen Phänotyp.
Die RNAi Technologie wird häufig in C. elegans angewandt, um umgekehrt genetische Screens oder Hochdurchsatz Screens auszuführen, oder als Werkzeug um entwicklungsbiologische Fragen zu behandeln. In diesem Video zeigen wir euch die Grundlagen der RNA Interferenz und wie die RNAi Methode in C. elegans angewandt wird. Woir behandeln außerdem wie Forscher RNAi als Werzeug verwenden, um weit verbreitete biologische Prozesse besser zu verstehen.
Fangen wir an zu verstehen wie die RNA Interferenz funktioniert. C. elegans essen Bakterien, welche mit Plasmiden transformiert worden sind, die doppelsträngige RNA kodieren, die komplementär zu dem Gen ist welches man abschalten möchte. Wie wir schon erwähnt haben, essen C. elegans die transformierten Bakterien. Durch einen Mechanismus der nicht bekannt ist gelangt die dsRNA in die Gewebe wenn sie gegessen wurde.
Wenn sie ersteinmal in der Zelle ist, schneidet das Enzym Dicer die doppelsträngige RNA in kurze Interferenz RNA, oder siRNA, welche zwischen 21 und 23 Nukleotiden lang ist. Danach bindet sich die siRNA an den RNA-induced silencing complex („RISC“), wo sie sich entwindet. Der siRNA/RISC Komplex bindet dann die Ziel-mRNA durch die Bindung der komplementären Basensequenz. Das führt zu der Degradierung der mRNA, wodurch das Gen abgeschaltet wird.
Bevor man mit dem Verfahren beginnt, muss man die Bakterien vorbereiten, welche die doppelsträngige RNA von Interesse exprimieren. Bibliotheken der Bakterien, welche dsRNA Plasmide für mehrere tausende von Genen enthalten, sind kommerziell erhältlich. Sonst muss die Ziel-Gen Sequenz in das Plasmid durch Standardmethoden kloniert werden. Das Plasmid enthält ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampizilin, welchens benutzt wird, um bakterielle Kolonien, welche das Plasmid enthalten, auszuwählen.
Danach werden Standardmethoden benutzt, um das Plasmid mit der dsRNA von Interesse in den DE3 E. coli Bakterienstamm zu transformieren, welcher dann die doppelsträngige RNA exprimiert. Man sollte die Bakterien auch mit einem leeren Plasmid als Kontrolle transformieren. Es ist wichtig zu wissen, dass der E. coli Stamm in diesen Experimenten keine RNA Polymerase III hat, durch welche sonst die doppelsträngige RNA zerstört werden würde. Die Bakterien enthalten auch ein durch IPTG induzierbares Gen für die T7 DNA Polymerase, welche die dsRNA in dem Plasmid transkribiert. Letztens enthalten die Bakterien auch noch eine Tetracyclin und Carbenicillin Resistenz, um die RNA Polymerase III Expression zu erhalten und um ungewolltes Bakterienwachstum zu verhindern.
Danach verteilt man die transformierten HT115 (DE3) Bakterien auf Agarplatten, welche 12.5 µg/ml Tetracyclin und 25 µg/ml Carbenicillin enthalten. Man inkubiert die Platten bei 37°C und erhält Bakterienkolonien am nächsten Morgen. Dann wählt man eine einzelne Bakterienkolonie aus und gibt diese zu 1 ml LB Brühe, welche 100 µg/ml Ampizillin enthält, um Bakterien, welche das Plasmid enthalten, zu selektieren. Die Mischung wird dann über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht gibt man 5 ml LB Brühe, welche 100 µg/ml Ampizillin enthält zu der Kultur und inkubiert sie nachmals für 4-6 Stunden bei 37°C.
Wenn die Bakterien fertig sind, können die RNAi Wurmplatten für die Fütterung vorbereitet werden. RNAi Wurmplatten enthalten: Agar, Wasser, Carbenicillin, Wurm-Medium Mischung, und IPTG um die T7 DNA Polymerase in den Bakterien zu induzieren, welche die dsRNA in dem Plasmid transkribiert. Man gibt 0.5 ml Bakterienkultur zu der RNAi Wurmplatte und inkubiert sie über Nacht bei 37°C, um einen Rasen aus Bakterien herzustellen.
Bevor man die Würmer auf die RNAi Platte transferiert, ist es wichtig das Entwicklungsstadium der Würmer zu synchronisieren, so dass die phänotypischen Unterschiede nicht ein Artefakt der verschiedenen Entwicklungsstadien sind. Um das Entwicklungsstadium zu synchronisieren, sterilisiert man zuerst einen Drahtspatel mit einer Flamme.
Nun benutzt man den Wurmspatel um L4 Würmer auf die RNAi Platten zu geben, und inkubiert diese bei 20°C, wo sie zu jungen, eilegenden Erwachsenen heranreifen. Nun transferiert man die jungen Erwachsenen auf eine neue RNAi Platte und inkubiert diese für 6-8 Stunden bei 20°C wo die Eier gelegt werden. Wenn alle erwachsenen Würmer entfernt worden sind, sind die Eier von der Entwicklung her synchronisiert. Schließlich lässt man die Würmer auf den RNAi Platten heranwachsen, bis sie das Entwicklungsstadium von Interesse für die Analyse erreicht haben.
Um die Würmer zu visualisieren, muss ein Objektträger mit einem 4% Agarpolster vorbereitet werden. Zuerst werden Nummer 2 Objektträger mit einem Klebeband versehen, durch welches Platzhalter entstehehen, die eine gleichmäßige Dicke des Agarpolsters gewährleisten. Man setzt einen sauberen Objektträger zwischen die Platzhalter und pipettiert darauf 150 µl einer 4% geschmolzenen Agarlösung. Man bedeckt die geschmolzene Agarose schnell mit einem zweiten Objektträger rechtwinklig von den Platzhaltern. Nun trennt man die Objektträger sanft voneinander und das Agarpolster hängt auf einem Objektträger fest.
Danach gibt man 10 µl eines Betäubungsmittels, wie zum Beispiel Natriumazid, auf das Agarpolster, um die Tiere bewegungsunfähig zu machen. Mit einem Platin-Spatel transferiert man die Würmer auf das Agarpolster mit dem Betäubungsmittel und bedeckt es mit einem Deckglas. Nun kann man die Würmer mit dem Mikroskop betrachten. Man vergleicht die Würmer, welche die RNAi Gen Abschaltung unterlaufen haben mit den Kontrollen, und vermerkt die Unterschiede in Größe, Entwicklungsstadium, Morphologie, Lokalisation von fluoreszent-markierten Proteinen und anderen potenziellen Phänotypen.
Eine der wertvollsten Anwendungen der RNA Interferenz ist es umgekehrt genetische Screens einfach auszuführen. Ein umgekehrt genetischer Screen ist ein Mittel, um Genfunktionen durch die Abschaltung von einer Reihe von bekannten Genen zu entdecken, um danach den Phänotyp zu untersuchen. Zum Beispiel können Forscher Bibliotheken von Bakterien benutzen, welche die dsRNAs von fast allen Genen in dem C. elegans Genom exprimieren. Die Bakterien werden in Multiwellplatten kultiviert und dann an die Würmer verfüttert. Danach werden die phänotypischen Effekte der RNA Genabschaltung betrachtet, was neue Einblicke in die normale Funktion der Gene in vivo gibt.
Automatisierte genetische Screens sind umgekehrt genetischen Screens mit extrem hohen Durchsatz, in welchen das ganze C. elegans Genom sehr leicht durch die Benutzung von Robotern, welche tausende bakterielle Klone handhaben, abgeschaltet werden und mit der Benutzung von spezialisierten Instrumenten quantitativ analysiert werden kann.
Zum Beispiel können in transgenen Würmern, welche ein fluoreszentes Reportergen für das antimikrobiale Peptid Gen npl29 haben, tausende Gene durch das Füttern von RNAi abgeschaltet werden. Zur gleichen Zeit werden den Würmern Pilzsporen zugesetzt. Dann wird die anti-mikrobiale Peptidantwort auf den Fungus untersucht.
Die C. elegans Entwicklung wird häufig mit RNAi untersucht. Wissenschaftler können die RNA Interferenz benutzen, um Gene (oder eine Sammlung von Genen) auszuschalten und zu untersuchen welche Auswirkungen diese Gene auf Entwicklungsprozesse oder Entwicklungszeitpunkte haben. Zum Beispiel kann man durch RNAi Gene identifizieren, welche die Entwicklung verlangsamen, oder Gene, welche in der Organentwicklung wichtig sind.
Das war die Einführung in die RNA Interferenz in C. elegans von JoVE. Wir haben uns angeschaut wie die RNA Interferenz funktioniert und wie die RNA Interferenz in C. elegans durch die Fütterung von Bakterien benutzt wird. Die RNA Interferenz ist ein wertvolles Werkzeug für umgekehrt genetische Screens, einschließlich von automatisierten Hochdurchsatz-Screens, und um die Entwicklung zu Untersuchen. Danke für eure Aufmerksamkeit.
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