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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Overview

A interferência de RNA (RNAi) é uma técnica amplamente utilizada na qual o RNA de duplar encalha é exogenoumente introduzido em um organismo, causando o knockdown de um gene alvo. No nematode, C. elegans, RNAi é particularmente fácil e eficaz porque pode ser entregue simplesmente alimentando as bactérias vermes que expressam RNA duplo encalhado (dsRNA) que é complementar a um gene de interesse. Primeiro, este vídeo introduzirá o conceito de interferência de RNA e explicará como ele causa knockdown genético direcionado. Em seguida, demonstraremos um protocolo para o uso de RNAi em C. elegans,que inclui a preparação das bactérias e placas de verme RNAi, cultivo dos vermes, e como avaliar os efeitos do RNAi sobre os vermes. O RNAi é frequentemente usado para realizar telas genéticas reversas, a fim de revelar quais genes são importantes para realizar processos biológicos específicos. Além disso, telas genéticas reversas automatizadas permitem a derrubada eficiente e a análise de uma grande coleção de genes. Por fim, a RNAi é frequentemente usada para estudar o desenvolvimento de C. elegans. Desde sua descoberta, os cientistas têm usado a RNAi para fazer um tremendo progresso na compreensão de muitos fenômenos biológicos.

Procedure

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A interferência de RNA, ou RNAi, é uma técnica amplamente utilizada na qual o RNA duplo encalhado é introduzido a um organismo, resultando em silenciamento genético direcionado. A descoberta vencedora do Nobel da interferência do RNA permitiu que os pesquisadores silenciem qualquer gene C. elegans, a fim de determinar sua função. Podemos induzir RNAi em C. elegans preparando primeiro placas com E. coli que expressam gene dsRNA, que os vermes vão comer. Em seguida, vermes de estágio 4 são transferidos para as placas RNAi e autorizados a colocar ovos. Na fase desejada de desenvolvimento, a prole é coletada e pontuada para fenótipos.

A tecnologia RNAi é frequentemente usada em C. elegans para conduzir telas genéticas reversas, telas automatizadas de alto rendimento e como uma ferramenta para estudar processos de desenvolvimento. Neste vídeo, explicaremos o conceito de interferência de RNA, demonstraremos como usar a técnica RNAi em C. elegans e discutiremos como os cientistas estão usando o RNAi como uma ferramenta para entender melhor os processos biológicos generalizados.

Vamos começar mostrando como a interferência do RNA funciona. No caso de C. elegans, os vermes são alimentados com bactérias, que foram transformadas com plasmídeos que codificam para RNA duplo encalhado complementar ao gene que você quer silenciar. Como mencionado anteriormente, C. elegans se alimentará das bactérias transformadas. Através de um mecanismo atualmente desconhecido, o dsRNA entra no tecido C. elegans uma vez ingerido.

Uma vez dentro da célula, a enzima Dicer corta o RNA duplo encalhado em RNA de interferência curta, ou siRNA, que tem entre 21 e 23 nucleotídeos de comprimento. Em seguida, o siRNA associa-se ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA, também conhecido como "RISC", e se desenrola. Em seguida, o complexo siRNA/RISC vincula o mRNA alvo através de emparelhamento de base complementar. Isso leva à degradação do mRNA, derrubando assim esse gene.

Antes de iniciar o procedimento, as bactérias que expressam o RNA duplo encalhado de interesse precisam estar preparadas. Bibliotecas de bactérias que contêm plasmídeos codificadores de dsRNA para milhares de genes estão disponíveis comercialmente. Caso contrário, a sequência genética alvo precisa ser clonada em um plasmídeo usando técnicas padrão de clonagem. O plasmídeo contém um gene para resistência à ampicilina antibiótico, que pode ser usado para selecionar para colônias bacterianas que contêm o plasmídeo.

Em seguida, use técnicas padrão para transformar a codificação plasmida seu dsRNA de interesse na cepa (DE3) da bactéria E. coli que expressará o RNA de dupla lanteudo. Além disso, transforme as bactérias com um plasmídeo vazio como controle. É importante ressaltar que a cepa de E. coli usada nesses experimentos carece de polimerase RNA III, que de outra forma digeriria RNA duplo encalhado. Esta bactéria também contém um gene indutível IPTG para polimerase de DNA T7, que transcreve o dsRNA no plasmídeo. Por fim, as bactérias (DE3) são resistentes à tetraciclina e à carbenicilina, para manter a expressão de polimerase RNA III e prevenir o crescimento bacteriano indesejado.

Espalhe as bactérias HT115 (DE3) transformadas em placas de ágar LB contendo 12,5 μg/ml de tetraciclina e 25 μg/ml de carbenicilina. Incubar durante a noite a 37 °C e na manhã seguinte colônias bacterianas estarão presentes nas placas. Em seguida, selecione uma única colônia de bactérias e adicione-a a 1 ml de caldo LB contendo 100 μg/ml de ampicilina para selecionar para bactérias que contenham o plasmídeo. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação. Após a incubação durante a noite, adicione 5 ml de caldo LB contendo 100 μg/ml de ampicilina à cultura, e incubar por mais 4-6 horas a 37 °C.

Uma vez que as bactérias estejam prontas, as placas de verme RNAi precisam estar preparadas para a alimentação. As placas de verme RNAi contêm: ágar, água, carbenicilina, mistura média worm e IPTG para induzir a polimerase de DNA T7 nas bactérias que transcrevem o dsRNA no plasmídeo. Adicione 0,5 ml de cultura de bactérias às placas de verme RNAi e incubar durante a noite a 37 °C, criando um gramado bacteriano.

Antes de adicionar vermes às placas RNAi, é importante sincronizar o estágio de desenvolvimento do verme, de modo que quaisquer diferenças observadas no fenótipo não sejam um artefato do estágio de desenvolvimento. Para sincronizar os estágios de desenvolvimento, primeiro esterilizar uma picareta de fio de platina.

Use a picareta de minhoca para adicionar vermes L4 a cada placa RNAi, e incubar durante a noite a 20 °C, permitindo que eles se tornem adultos jovens que colocam ovos. Em seguida, transfira os jovens adultos para a nova placa RNAi e incubar por 6-8 horas a 20 °C, durante os quais os ovos são colocados. Uma vez que todos os adultos são removidos, esses ovos serão sincronizados desenvolvimentamente. Finalmente, permita que os vermes cresçam em placas RNAi até chegarem ao estágio de desenvolvimento de interesse para análise.

Para visualizar os vermes, um slide deve ser preparado com uma almofada de 4% de ágar. Primeiro, fita 2 lâminas de vidro com fita de rotulagem, criando espaçadores que garantem espessura uniforme da almofada de ágar. Coloque um deslizamento de vidro limpo entre os dois espaçadores e tubo cerca de 150 μl de 4% de ágar derretido sobre o slide. Cubra rapidamente o ágar derretido com slide adicional perpendicular aos espaçadores. Separe suavemente os slides e a almofada de ágar será aderida a um dos slides.

Em seguida, adicione 10 μl de um anestésico como o azida de sódio ao ágar pad para imobilizar os animais. Usando uma picareta de fio de platina, transfira os vermes para a almofada de ágar com anestésico e adicione um deslizamento de tampa. Finalmente, observe vermes sob um microscópio. Compare os vermes que tiveram o knockdown genético RNAi com controles, e note diferenças de tamanho, estágio de desenvolvimento, morfologia, padrões de localização de proteínas fluorescentes marcadas e outros fenótipos potenciais.

Uma das aplicações mais valiosas da interferência de RNA é a capacidade de executar facilmente telas genéticas reversas. Uma tela genética reversa é uma abordagem para descobrir a função genética derrubando uma coleção conhecida de genes e avaliando o resultado fenotípico. Por exemplo, os pesquisadores podem usar uma biblioteca de bactérias que expressam dsRNA para quase todos os genes do genoma C. elegans. Essas bactérias são cultivadas em placas multi-poços e alimentadas com os vermes. Em seguida, os efeitos fenotípicos do knockdown RNAi de muitos genes podem ser avaliados, dando uma visão das funções genéticas in vivo normais.

Telas genéticas automatizadas são um tipo de tela genética reversa que são extremamente altas de rendimento. Em telas genéticas automatizadas, todo o genoma de C. elegans pode ser derrubado muito facilmente usando o manuseio robótico dos milhares de clones bacterianos, e usando instrumentos especializados para análise quantitativa.

Por exemplo, vermes que expressam um repórter fluorescente transgênico para o gene peptídeo antimicrobiano nlp 29, estão sujeitos à derrubada rnai de milhares de genes através da alimentação bacteriana. Ao mesmo tempo, os vermes são introduzidos aos esporos fúngicos. Em seguida, a resposta do peptídeo antimicrobísmo ao fungo pode ser avaliada.

C. elegans desenvolvimento é frequentemente estudado usando RNAi. Os cientistas podem usar a interferência do RNA para derrubar qualquer gene (ou coleta de genes) de interesse e avaliar exatamente como esse gene afeta processos durante o desenvolvimento e/ou o tempo de desenvolvimento. Por exemplo, o knockdown rnai pode revelar genes que atrasam o desenvolvimento quando derrubados, ou genes envolvidos no desenvolvimento de órgãos.

Você acabou de assistir a introdução de JOVE à interferência do RNA em C. elegans. Revisamos como funciona a interferência do RNA e como usar a interferência de RNA em C. elegans através da alimentação bacteriana. A interferência de RNA é uma ferramenta valiosa para telas genéticas reversas, incluindo telas automatizadas de alto rendimento, e também é uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento. Obrigado por assistir!

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