Overview
Inmunohistoquímica (IHC) es una técnica utilizada para visualizar la presencia y localización de proteínas en los tejidos. Las larvas de Drosophila son particularmente susceptibles de IHC debido a la facilidad con que puede ser procesados para la tinción. Además, las larvas son transparentes, lo que significa que los tejidos pueden ser visualizados sin necesidad de disección.
En IHC, las proteínas se detectan en última instancia con los anticuerpos que se unen específicamente a "epitopes" dentro de la proteína de interés. Para preservar estos epítopos, los tejidos deben ser fijados antes de la tinción. Además, a fin de anticuerpos penetrar en las membranas, las células deben permeabilized con detergentes. Este artículo de video ofrece una vista detallada de los reactivos, instrumentos y procedimientos necesarios para la tinción de tejidos larvales disecados, incluyendo fijación, bloqueo y pasos de tinción. También es una demostración de tejido técnicas de montaje para microscopía de fluorescencia. Finalmente, se proporcionan ejemplos de la amplia gama de aplicaciones de estas técnicas (y algunas variaciones sobre ellos).
Procedure
Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente estudiado debido a su versatilidad y facilidad de uso.
Inmunohistoquímica en preparaciones de larvas de Drosophila es un método valioso que puede proporcionar información sobre la presencia, localización y colocalización de proteínas.
Este video cubre los métodos esenciales para la disección, fijación, bloqueo y montaje del tejido larvas de Drosophila y ejemplos de sus aplicaciones.
Inmunohistoquímica es modificado de un proceso que utiliza anticuerpos para apuntar, enlazar y visualizar, en definitiva, las proteínas específicas en el tejido.
Inmunohistoquímica de la larva de Drosophila depende de disección adecuada, que exige precisión y puntualidad debido a la sensibilidad de los tejidos larvales.
La disección se realiza típicamente en tampón fosfato salino, o "PBS" para abreviar.
Sobre extracción de órganos se colocan temporalmente en PBS – una solución salina con el mismo pH como el pH interno de la larva.
Después de la disección el siguiente paso en Drosophila larva IHC es fijación.
La fijación es un proceso donde el tejido se coloca en una solución basada en formaldehído diluida, que conserva el tejido.
Esta solución de fijación impide la degradación enzimática de las proteínas en el tejido.
Tras fijación, varios pasos de lavado producen durante todo el proceso de inmunotinción con PBS conteniendo Triton-X, llamado SAFT.
Triton-X100 proporciona una pequeña cantidad de detergente que sirve como un interruptor de tensión superficial y permeabilizes la célula, permitiendo que los anticuerpos y otros reactivos para entrar.
Después de la fijación y el lavado, el tejido está listo para bloquear.
Solución de bloqueo contiene proteínas que se unen al tejido y ocupan sitios de Unión inespecíficos que de lo contrario serían cumplir los anticuerpos específicos del destino. El bloqueo ayuda a evitar que la señal de un falso positivo de la proteína.
Tras bloquear el tejido está preparado para la tinción.
La coloración incorpora altamente específico anticuerpo «primario» que se une a una proteína Diana llamada antígeno.
Un "secundario" anticuerpos conjugados a una molécula de los periodista une al anticuerpo primario.
La molécula de los periodista emite una señal localizada que puede ser visualizada, que a menudo es fluorescente en la naturaleza.
Tras el paso de incubación de cada anticuerpo, anticuerpo exceso se lava para eliminar los anticuerpos que han consolidado un.
Después del proceso de tinción, la muestra debe ser montada.
Para ver los resultados de la coloración, el tejido debe ser cuidadosamente montado en diapositivas.
Se utiliza un reactivo grueso o medio de montaje para encajonar el tejido.
La muestra es entonces lista para ser vista bajo el microscopio.
Ahora que hemos pasado a través de los principios de inmunohistoquímica de Drosophila , estamos listos para ver cómo se hace.
En este video nos centraremos en los reactivos, instrumentos y procesos utilizados en la inmunohistoquímica del principio de cerebro larvas de Drosophila con fijación.
El proceso que estamos siguiendo utiliza todo el cerebro y se conoce como Monte toda la coloración.
Mientras que el procedimiento de disección difiere dependiendo del tipo de tejido utilizado para el experimento, los principales pasos de IHC siguen siendo los mismos por lo que podrá saltarse el paso de fijación.
Una vez completada la disección del cerebro larvas, quitar PBS con una pipeta.
Añadir fijador e incubar según el protocolo específico, para cerebros 23 min.
Tras fijación, lavar las muestras cuatro veces en SAFT.
Incubar las muestras en solución para por lo menos 30 min temperatura de bloqueo.
Utilizando las diluciones apropiadas, incubar en la solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
Después de la incubación lavar cerebros cuatro veces previamente en SAFT con una punta de pipeta a temperatura ambiente.
Incubar las muestras en el anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C en la oscuridad para impedir el blanqueo de los fluoróforos.
Una vez más, lavar cerebros cuatro veces en SAFT.
Equilibre los cerebros en el medio de montaje durante una hora.
Después de equilibrar la transferencia los cerebros en una diapositiva con una pipeta de p200 con la punta cortada.
Coloque los espaciadores alrededor de la muestra para evitar que se aplaste.
Coloque un cubreobjetos sobre las muestras.
Sellar los bordes de deslizamiento con esmalte de uñas. Cerebros larvales están listos para ser visualizado con inmunohistoquímica
Ahora que hemos cubierto la inmunohistoquímica del cerebro de Drosophila , Veamos algunas formas alternativas de aplicación de procedimientos de IHC.
Alternativas técnicas de disección y fijación pueden utilizarse para preparar larva Drosophila para la proyección de imagen.
En este experimento, los investigadores quieren saber cómo las células generan formas específicas.
Lo hacen trazando las morfologías de larvas traqueales células terminales.
Los investigadores, aprovechando una línea mutante de mosca que expresa GFP.
La expresión de GFP es inducida por exposición al calor en baño de agua
Las larvas son seleccionadas bajo un microscopio de disección con fluorescencia.
Vuela emitiendo fluorescencia indica activación con éxito de GFP.
Estas moscas son sometidas a una forma alternativa de fijación por calor; la disección no es necesaria.
Después de usar el software para ayudar a la localización, morfología celular de ramas traqueales y lumen se identifica.
El ovario del Drosophila es un excelente modelo para entender cómo las células madre interactuar con su entorno celular.
IHC de Drosophila ovarios comienza por identificar las hembras de Drosophila por presencia de ovarios contra testículos, que son evidentes en los machos.
Recogido las larvas hembra se transfieren a pocillos individuales donde se disecan cuidadosamente para obtener una estructura conocida como la grasa corporal, que alberga los ovarios.
Cuerpos grasos son fijos y manchados, y luego - después de colocar el tejido en diapositivas - los ovarios están separados del tejido de la grasa corporal. Después de montaje y visualización de las diapositivas, tinción fluorescente revela la ubicación de las células somáticas y células de germen primordiales en el ovario larval.
Inmunohistoquímica de las larvas de Drosophila tiene muchos paralelos a IHC pupa y adulto.
Por ejemplo, los investigadores pueden utilizar IHC para buscar en retinas de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo: larvas, pupa y adulto, lo que ilustra la diferencia entre los procedimientos de inmunohistoquímica pupas, larvas y adultos.
Los resultados muestran las distintas etapas de desarrollo de retinas de Drosophila .
Inmunohistoquímica de la larva de Drosophila es una herramienta con una gran cantidad de aplicaciones y variaciones. En este video cubrimos los procedimientos para larvas de immunostaining, incluyendo disección, fijación, tinción y montaje. ¡Gracias por ver!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
