Overview
L’immunohistochimie (IHC) est une technique utilisée pour observer la présence et la localisation de protéines dans les tissus. Les larves de drosophiles sont particulièrement propices à l’IHC en raison de la facilité de leurs procédures de marquage. Les larves sont de plus transparentes, de sorte que certains tissus peuvent être observés sans dissection.
En IHC, les protéines sont ultimement détectées grâces aux anticorps qui se lient spécifiquement aux « épitopes » contenus dans les protéines d’intérêt. Les tissus doivent être fixés avant le marquage pour préserver ces épitopes. De plus les cellules doivent être rendues perméables par l’addition de détergents afin de permettre aux anticorps de pénétrer les membranes. Cette vidéo donne une vision détaillée des réactifs, outils et procédures nécessaires au marquage de tissus larvaires disséqués, procédures comprenant les étapes de fixation, de blocage et de marquage. Cette vidéo présente également les techniques de montage de tissus pour la microscopie à fluorescence. Elle se termine en donnant quelques exemples de leur vaste domaine d’applications (ainsi que quelques variations).
Procedure
La Drosophila melanogaster est un organisme modèle faisant l’objet de nombreuses études en raison de sa polyvalence et de sa facilité d’utilisation.
L’immunohistochimie effectuée sur les préparations de larves de drosophile est une méthode très utile pouvant fournir des informations sur la présence, l'emplacement et la co-localisation de protéines.
Cette vidéo portera sur les méthodes essentielles de dissection, fixation, blocage et montage de tissus larvaires de drosophile et fournira des exemples d'utilisation.
L’immunohistochimie est un procédé qui utilise des anticorps modifiés pour cibler des protéines spécifiques dans les tissus, se lier à elles et finalement permettre leur observation.
L’immunohistochimie des larves de drosophiles repose sur la qualité de la dissection. Celle-ci demande de la précision et de la rapidité en raison de la sensibilité des tissus de larves.
La dissection est généralement effectuée dans une solution tampon de phosphate ou « PBS » (phosphate buffered saline en anglais).
Après l’extraction, les organes sont placés temporairement dans une solution saline de PBS ayant le même pH que le pH interne de la larve.
La dissection est suivie par la fixation au cours de l’IHC de larves de drosophile.
La fixation est un procédé suivant lequel un tissu est placé dans une solution à base de formol dilué, étape qui conduit à sa préservation.
Cette solution de fixation empêche la dégradation enzymatique des protéines dans le tissu.
Suite à la fixation, plusieurs étapes de lavage ont lieu au cours du processus d’immunomarquage ; ces lavages utilisent du PBS contenant du Triton-X, appelé PBS-T.
Le Triton-X100 apporte une faible quantité de détergent qui altère la tension de surface et perméabilise la cellule, permettant l'entrée d'anticorps et autres réactifs.
Après la fixation et les lavages, le tissu est prêt pour le blocage.
La solution de blocage contient des protéines qui se lient au tissu et occupent des sites de fixation non-spécifiques auxquels les anticorps adhèreraient en leur absence. Le blocage permet d’éviter un faux positif pour le signal de protéines.
Apres le blocage, le tissu est prêt pour le marquage.
Le marquage inclut un anticorps “primaire” hautement spécifique qui se fixe à une protéine cible appelée antigène.
Un anticorps « secondaire » conjugué à une molécule marqueur se lie à l’anticorps primaire.
La molécule marqueur émet un signal localisé - souvent fluorescent - qui peut être observé.
Après chaque étape d’incubation des anticorps, l’excès d’anticorps non liés spécifiquement est éliminé par rinçage.
Après le marquage, l’échantillon doit être monté.
Le tissu doit être monté avec soin sur des lames afin d’observer les résultats du marquage.
Une résine ou milieu de montage est utilisé pour recouvrir le tissu.
L’échantillon est alors prêt pour l’observation au microscope.
Maintenant que nous avons présenté les principes de l’immunohistochimie de la drosophile, nous sommes prêts pour observer son déroulement.
Dans cette vidéo, nous porterons notre attention sur les réactifs, les outils et les procédés utilisés pour l'immunohistochimie du cerveau de la larve de drosophile, en commençant par la fixation.
Le procédé que nous employons utilise le cerveau entier et est connu comme le « whole mount staining » ou marquage sur organe entier.
Bien que les techniques de dissection diffèrent suivant les types de tissus considérés pour l’expérience, les principales étapes de l’IHC restent les mêmes donc nous passerons directement à l’étape de fixation.
Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.
Une fois la dissection du cerveau de larve achevée, retirez la solution de PBS à l'aide d'une pipette.
Ajoutez le fixateur et incubez selon votre propre protocole. Pour le cerveau, utilisez une durée de 23 minutes.
Après la fixation, rincez vos échantillons quatre fois au PBS-T.
Incubez vos échantillons dans une solution de blocage pendant au moins 30 minutes à température ambiante.
Equilibrez les cerveaux dans la solution de montage pendant une heure.
Après équilibration, transférez les cerveaux sur une lame en utilisant une pipette p200 dont la pointe de pipette a été coupée.
Placez des pièces d'espacement autour de l’échantillon afin d'éviter qu'il ne soit écrasé.
Placez une lamelle sur l’échantillon.
Scellez les bords de la lamelle au vernis à ongles. Les cerveaux de larves sont maintenant prêts à l’observation par immunohistochimie.
Maintenant que nous avons décrit l’immunohistochimie des cerveaux de drosophile, explorons d'autres manières d'utiliser les procédures de l'IHC.
Des techniques de dissection et de fixation alternatives peuvent être employées pour la préparation des larves de drosophiles pour l’imagerie.
Dans cette expérience, les chercheurs veulent comprendre comment les cellules génèrent leurs formes spécifiques.
Ils font cela en suivant les morphologies des cellules terminales de la trachée des larves.
Les chercheurs utilisent une lignée de mouches mutantes qui exprime la GFP.
L’expression de la GFP est induite dans l’échantillon par exposition à la chaleur dans un bain d'eau-marie.
Les larves sont choisies sous microscope de dissection à fluorescence.
Les mouches émettant de la fluorescence indiquent l’activation de la GFP.
Ces mouches sont soumises à une forme alternative de fixation par la chaleur et aucune dissection n’est nécessaire.
Après l’utilisation d'un logiciel pour aider au traçage, les morphologies cellulaires des branches de trachées et l’intensité lumineuse sont identifiées.
L’ovaire de la drosophile est un excellent modèle pour comprendre comment les cellules souches interagissent avec leur environnement cellulaire.
L’IHC des ovaires de drosophiles commence par l’identification des femelles de drosophile par la présence d'ovaires, par opposition aux testicules qui sont visibles chez les mâles.
Les larves femelles recueillies sont transférées dans des cupules individuelles où elles sont soigneusement disséquées afin d’obtenir une structure contenant les ovaires, connue en tant que corps gras.
Les corps gras sont fixés et marqués. Puis, après disposition des tissus sur les lames, les ovaires sont séparés du tissu de corps gras. Après le montage et l’observation des lames, le marquage fluorescent révèle l’emplacement des cellules somatiques et des cellules germinales primordiales dans l’ovaire larvaire.
L’immunohistochimie des larves de drosophiles a de nombreux parallèles avec l’IHC de la pupe et de l’adulte.
Par exemple, les chercheurs peuvent utiliser l’IHC pour observer les rétines de drosophile à différentes étapes de développement: larvaire, pupale et adulte; et peuvent ainsi illustrer la différence entre les procédures d’immunohistochimie pour ces différentes étapes.
Les résultats montrent les différentes étapes du développement de la rétine de drosophile.
L’immunohistochimie de la larve de drosophile est un outil ayant de nombreuses applications et variations. Dans cette vidéo, nous avons couvert les procédures d’immunomarquage des larves comprenant la dissection, la fixation, le marquage et le montage. Merci de votre attention!
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