Overview
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה המשמשת להדמיית נוכחותם ומיקוםם של חלבונים בתוך רקמות. זחלי Drosophila נוחים במיוחד ל- IHC בגלל הקלות שבה ניתן לעבד אותם להכתמה. בנוסף, הזחלים שקופים, כלומר ניתן לדמיין רקמות מסוימות ללא צורך בבית חיטוי.
ב- IHC, חלבונים מזוהים בסופו של דבר עם נוגדנים שנקשרים במיוחד ל"אפיטופים "בתוך חלבון העניין. על מנת לשמר אפיטופים אלה, יש לתקן רקמות לפני הכתם. יתר על כן, על מנת נוגדנים לחדור ממברנות, תאים חייבים להיות חלחל עם חומרי ניקוי. מאמר וידאו זה מציע תצוגה מפורטת של ריאגנטים, כלים ונהלים הדרושים להכתמת רקמות זחל ניתחו, כולל שלבי קיבעון, חסימה והכתמה. כמו כן מוצגת הדגמה של טכניקות הרכבה על רקמות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לבסוף, דוגמאות למגוון הרחב של יישומים לטכניקות אלה (וכמה וריאציות עליהם) מסופקות.
Procedure
Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל נחקר נרחב בשל צדדיות שלה ואת המתקן של שימוש.
אימונוהיסטוכימיה המבוצעת על תכשירי זחל Drosophila היא שיטה שלא יסולא בפז שיכולה לספק מידע על נוכחות, מיקום, ולוקליזציה משותפת של חלבונים.
וידאו זה יכסה את השיטות החיוניות עבור ניתוח, קיבעון, חסימה, הרכבה של רקמת זחל Drosophila ודוגמאות של היישומים שלהם.
אימונוהיסטוכימיה היא תהליך המשתמש בנוגדנים מותאמים כדי למקד, לאגד, ובסופו של דבר לדמיין חלבונים ספציפיים ברקמה.
אימונוהיסטוכימיה של זחל Drosophila תלויה בביתחות נאותות, הדורשות דיוק ולוחות זמנים בשל הרגישות של רקמת הזחל.
ניתוח נעשה בדרך כלל מלוחים חוצצים פוספט, או "PBS" בקיצור.
עם מיצוי איברים ממוקמים באופן זמני PBS â תמיסת מלח עם אותו pH כמו ה- pH הפנימי של הזחל.
לאחר הניתוח השלב הבא ב זחל Drosophila IHC הוא קיבעון.
קיבוע הוא תהליך שבו רקמה ממוקמת בתמיסה מבוססת פורמלדהיד מדוללת, המשמרת רקמה.
פתרון תיקון זה מונע פירוק אנזימטי של חלבונים ברקמה.
לאחר קיבעון, מספר שלבי כביסה מתרחשים לאורך כל תהליך החיסונים באמצעות PBS המכיל טריטון-X, הנקרא PBST.
Triton-X100 מספק כמות קטנה של חומר ניקוי המשמש כמפסק מתח פני השטח ומחלחל לתא, ומאפשר לנוגדנים ולריאגנטים אחרים להיכנס.
לאחר קיבעון ושטיפה, הרקמה מוכנה לחסימה.
פתרון החסימה מכיל חלבונים שנקשרים לרקמה ותופסים אתרים מחייבים לא ספציפיים שאליהם הנוגדנים הספציפיים למטרה היו נדבקים בהם בדרך אחרת. חסימה מסייעת במניעת אות חלבון חיובי כוזב.
לאחר חסימת הרקמה מוכן להכתמה.
הכתמים משלבים נוגדן "ראשוני" ספציפי ביותר שנקשר לחלבון מטרה הנקרא אנטיגן.
נוגדן "משני" המופץ למולקולת כתב קושר את הנוגדן העיקרי.
מולקולת הכתב פולטת אות מקומי שניתן לדמיין, שלעתים קרובות הוא פלואורסצנטי בטבע.
לאחר כל שלב דגירה נוגדן, נוגדן עודף נשטף כדי להסיר את כל הנוגדנים שנקשרו באופן לא מדעי.
לאחר תהליך הכתמים, יש להרכיב את המדגם.
על מנת לראות את התוצאות של כתמים, הרקמה חייבת להיות מותקנת בקפידה על שקופיות.
ריאגנט עבה או מדיום הרכבה משמש כדי לעטוף את הרקמה.
לאחר מכן, המדגם מוכן להצגה מתחת למיקרוסקופ.
עכשיו שעברנו על העקרונות של אימונוהיסטוכימיה של דרוסופילה, אנחנו מוכנים לראות איך עושים את זה.
בסרטון זה נתמקד בריאגנטים, בכלים ובתהליכים המשמשים באימונוהיסטוכימיה של מוח הזחל של דרוסופילה שמתחילים עם קיבעון.
התהליך שאנו עוקבים אחריו משתמש במוח כולו ומכונה מכתים הר שלם.
בעוד הליך הניתוח משתנה בהתאם לסוג הרקמה המשמש לניסוי, השלבים העיקריים של IHC נשארים זהים ולכן נדלג לשלב הקיבעון.
לאחר ניתוח של מוחות זחל הושלמה, להסיר PBS עם pipette.
הוסף קיבוע ודגרה לפי הפרוטוקול הספציפי שלך, למוחות להשתמש 23 דקות.
לאחר קיבעון, לשטוף דגימות ארבע פעמים PBST.
דגימות דגירה בחסימת פתרון לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.
באמצעות הדילול המתאים, דגירה בתמיסת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה ב 4 °C (70 °F).
לאחר תקופת הדגירה לשטוף את המוח ארבע פעמים PBST עם טיפ פיפטה בטמפרטורת החדר.
לדגור על הדגימות בנוגדן משני לילה ב 4 °C (60 °F) בחושך כדי למנוע פלואורופורים מלהלבין.
שוב, לשטוף את המוח ארבע פעמים PBST.
ישיול המוחות במדיום הרכבה למשך שעה אחת.
לאחר שיווי משקל להעביר את המוח לשקופית באמצעות פיפטה p200 עם הקצה מנותק.
מניחים מרווחים סביב המדגם כדי למנוע ממנו להימחץ.
מניחים כיסוי מעל הדגימות.
אוטמים את קצות ההחלקה עם לק. מוחות זחל מוכנים כעת להדמיה עם אימונוהיסטוכימיה
עכשיו שכיסינו את האימונוהיסטוכימיה של מוחות דרוזופילה, בואו נעבור על כמה דרכים חלופיות ליישם נהלי IHC.
ניתן להשתמש בטכניקות ניתוח קיבעון חלופיות להכנת זחל Drosophila להדמיה.
בניסוי זה, חוקרים רוצים ללמוד כיצד תאים יוצרים צורות ספציפיות.
הם עושים זאת על ידי התחקות אחר המורפורוגיות של תאי מסוף קנה הנשימה.
החוקרים מנצלים קו זבוב מוטנטי שמבטא GFP.
ביטוי GFP נגרם על ידי חשיפה לחום באמבט מים
זחלים נבחרים תחת מיקרוסקופ ניתוח עם פלואורסצנטיות.
זבובים הפולטים פלואורסצנטיות מצביעים על הפעלה מוצלחת של GFP.
זבובים אלה מוגשים לצורה חלופית של קיבעון על ידי חום; אין צורך בבית חיטוי.
לאחר שימוש בתוכנה כדי לסייע במעקב, מזוהים מורפולוגיות תאיות של ענפי קנה הנשימה ולומן .
השחלה Drosophila הוא מודל מצוין להבנת איך תאי גזע אינטראקציה עם הסביבה התאית שלהם.
IHC של שחלות Drosophila מתחיל על ידי זיהוי נקבות Drosophila על ידי נוכחות של שחלות לעומת האשכים, אשר ניכרים אצל גברים.
זחלים נשיים שנאספו מועברים לבארות בודדות שבהן הם נותחו בקפידה כדי להשיג מבנה המכונה גוף השומן, המאכלס את השחלות.
גופי שומן קבועים ומוכתמים, ולאחר מכן - לאחר הנחת הרקמה על שקופיות - השחלות מופרדות מרקמת גוף השומן. לאחר הרכבה והדמיה של השקופיות, כתמים פלואורסצנטיים חושפים את המיקום של תאים סומטיים ותאי נבט קדמוניים בשחלה הזחלית .
אימונוהיסטוכימיה של זחלי Drosophila יש הקבלות רבות ל- IHC הגופי והמבוגר.
לדוגמה, חוקרים יכולים להשתמש ב- IHC כדי להסתכל על רשתיות Drosophila בשלבים התפתחותיים שונים: זחל, pupal, ומבוגר, ובכך להמחיש את ההבדל בין נהלי pupal, זחל, ו נהלי אימונוהיסטוכימיה למבוגרים.
התוצאות מראות את שלבי ההתפתחות השונים של רשתיות Drosophila.
אימונוהיסטוכימיה של זחל Drosophila הוא כלי עם כמות גדולה של יישומים וריאציות. בסרטון זה כיסינו את הנהלים לחיסון זחלים כולל ניתוח, קיבעון, כתמים והרכבה. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
