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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Drosophila Larval IHC

Overview

A imunohistoquímica (IHC) é uma técnica usada para visualizar a presença e localização de proteínas dentro dos tecidos. As larvas de drosophila são particularmente favoráveis ao IHC devido à facilidade com que podem ser processadas para coloração. Além disso, as larvas são transparentes, o que significa que alguns tecidos podem ser visualizados sem a necessidade de dissecção.

No IHC, as proteínas são finalmente detectadas com anticorpos que se ligam especificamente a "epítopos" dentro da proteína de interesse. Para preservar esses epítopos, os tecidos devem ser fixados antes da coloração. Além disso, para que os anticorpos penetrem nas membranas, as células devem ser permeabilizadas com detergentes. Este artigo em vídeo oferece uma visão detalhada dos reagentes, ferramentas e procedimentos necessários para a coloração de tecidos larvais dissecados, incluindo fixação, bloqueio e etapas de coloração. Destaque também para uma demonstração de técnicas de montagem de tecidos para microscopia de fluorescência. Finalmente, são fornecidos exemplos da ampla gama de aplicações para essas técnicas (e algumas variações sobre elas).

Procedure

Drosophila melanogaster é um organismo modelo amplamente estudado devido à sua versatilidade e facilidade de uso.

A imunohistoquímica realizada nas preparações larvais de Drosophila é um método inestimável que pode fornecer informações sobre a presença, localização e co-localização de proteínas.

Este vídeo abordará os métodos essenciais para a dissecção, fixação, bloqueio e montagem de tecido larval Drosophila e exemplos de suas aplicações.

A imunohistoquímica é um processo que usa anticorpos modificados para atingir, ligar e, finalmente, visualizar proteínas específicas no tecido.

A imunohistoquímica da larva de Drosophila depende da dissecção adequada, que exige precisão e pontualidade devido à sensibilidade do tecido larval.

A dissecção é normalmente feita em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou "PBS" para abreviar.

Após a extração os órgãos são temporariamente colocados em PBS â uma solução salina com o mesmo pH do pH interno da larva.

Após a dissecção, o próximo passo na larva Drosophila IHC é a fixação.

A fixação é um processo onde o tecido é colocado em uma solução diluída à base de formaldeído, que preserva o tecido.

Esta solução de fixação evita a quebra enzimática de proteínas no tecido.

Após a fixação, várias etapas de lavagem ocorrem durante todo o processo de imunossuagem usando PBS contendo Triton-X, chamado PBST.

Triton-X100 fornece uma pequena quantidade de detergente que serve como um disjuntor de tensão superficial e permeabiliza a célula, permitindo que anticorpos e outros reagentes entrem.

Após fixação e lavagem, o tecido está pronto para o bloqueio.

A solução de bloqueio contém proteínas que se ligam ao tecido e ocupam locais de ligação não específicos aos quais os anticorpos específicos do alvo adeririam de outra forma. O bloqueio ajuda a prevenir um falso sinal de proteína positivo.

Depois de bloquear o tecido é preparado para coloração.

A coloração incorpora um anticorpo "primário" altamente específico que se liga a uma proteína alvo chamada antígeno.

Um anticorpo "secundário" conjugado a uma molécula de repórter liga o anticorpo primário.

A molécula do repórter emite um sinal localizado que pode ser visualizado, que muitas vezes é fluorescente na natureza.

Após cada etapa de incubação de anticorpos, o excesso de anticorpos é lavado para remover quaisquer anticorpos que tenham ligado sem especificamente.

Após o processo de coloração, a amostra deve ser montada.

Para ver os resultados da coloração, o tecido deve ser cuidadosamente montado em lâminas.

Um reagente espesso ou meio de montagem é usado para encear o tecido.

A amostra está então pronta para ser vista sob o microscópio.

Agora que passamos pelos princípios da imunohistoquímica de Drosophila, estamos prontos para ver como se faz.

Neste vídeo vamos focar nos reagentes, ferramentas e processos usados na imunohistoquímica do cérebro larval Drosophila começando com fixação.

O processo que estamos seguindo usa todo o cérebro e é conhecido como coloração de montagem inteira.

Embora o procedimento de dissecção difere dependendo do tipo de tecido usado para o experimento, as principais etapas do IHC permanecem as mesmas, por isso vamos pular para a etapa de fixação.

Uma vez que a dissecção dos cérebros larvais esteja completa, remova a PBS com uma pipeta.

Adicione fixativo e incubar de acordo com seu protocolo específico, para que o cérebro use 23 min.

Após a fixação, lave amostras quatro vezes em PBST.

Incubar amostras em solução de bloqueio por pelo menos 30 min de temperatura ambiente.

Usando as diluições apropriadas, incubar-se em solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C.

Após o período de incubação, lave os cérebros quatro vezes em PBST com uma ponta de pipeta à temperatura ambiente.

Incubar as amostras em anticorpos secundários durante a noite a 4 °C no escuro para evitar que os fluoroforos branqueem.

Novamente, lave os cérebros quatro vezes no PBST.

Equilibre os cérebros em meio de montagem por uma hora.

Após o equilíbrio, transfira os cérebros para um slide usando uma pipeta p200 com a ponta cortada.

Coloque os espaçadores ao redor da amostra para evitar que ela seja esmagada.

Coloque uma mancha de cobertura sobre as amostras.

Sele as bordas de deslizamento com esmalte. Cérebros larvais estão agora prontos para serem visualizados com imunohistoquímica

Agora que cobrimos a imunohistoquímica dos cérebros de Drosophila, vamos passar por algumas formas alternativas de aplicar procedimentos de IHC.

Técnicas alternativas de dissecção e fixação podem ser usadas para preparar larva de Drosophila para imagem.

Neste experimento, os pesquisadores querem aprender como as células geram formas específicas.

Eles fazem isso rastreando as morfologias das células terminais traqueais larvais.

Os pesquisadores se aproveitam de uma linha de moscas mutante que expressa GFP.

A expressão GFP é induzida pela exposição ao calor em um banho de água

Larvas são selecionadas sob um microscópio de dissecção com fluorescência.

Moscas que emitem fluorescência indicam ativação bem sucedida de GFP.

Estas moscas são submetidas a uma forma alternativa de fixação por calor; nenhuma dissecção é necessária.

Após o uso de software para auxiliar o rastreamento, são identificadas morfologias celulares de ramos traqueais e lúmen.

O ovário Drosophila é um excelente modelo para entender como as células-tronco interagem com seu ambiente celular.

O IHC dos ovários de Drosophila começa pela identificação de fêmeas de Drosophila pela presença de ovários versus testículos, que são aparentes em machos.

As larvas fêmeas coletadas são transferidas para poços individuais onde são cuidadosamente dissecadas para obter uma estrutura conhecida como corpo de gordura, que abriga os ovários.

Corpos de gordura são fixos e manchados, e então - depois de colocar o tecido em lâminas - os ovários são separados do tecido corporal gordo. Após a montagem e visualização dos slides, a coloração fluorescente revela a localização de células sommáticas e células germinativas primordiais no ovário larval .

A imunohistoquímica das larvas de Drosophila tem muitos paralelos com pupal e IHC adulto.

Por exemplo, os pesquisadores podem usar o IHC para olhar as retinas de Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento: larval, pupal e adulto, ilustrando assim a diferença entre procedimentos de pupal, larval e imunohistoquímica adulta.

Os resultados mostram as várias etapas de desenvolvimento das retinas de Drosophila.

A imunohistoquímica da larva de Drosophila é uma ferramenta com uma grande quantidade de aplicações e variações. Neste vídeo, cobrimos os procedimentos para larvas imunossustaining, incluindo dissecção, fixação, coloração e montagem. Obrigado por assistir!

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