Overview
Ceanorhabditis elegans é uma ferramenta poderosa para ajudar a entender como os organismos se desenvolvem de uma única célula em uma vasta gama interconectada de tecidos funcionais. Os primeiros trabalhos em C. elegans rastrearam a linhagem e estrutura celular completas no nível de microscopia eletrônica, permitindo aos pesquisadores uma visão sem precedentes sobre a conexão entre genes, desenvolvimento e doenças. Apreciar o programa de desenvolvimento estereotipado e reprodutivo de C. elegans é essencial para usar este organismo modelo ao máximo experimental.
Este vídeo lhe dará uma olhada no desenvolvimento de um verme da fertilização à eclosão, e caminhará com você através dos estágios de vida das larvas recém-eclodidas em sua jornada para a maturidade reprodutiva. O vídeo detalhará como os principais eixos são estabelecidos, que as células fundadoras dão origem a quais tecidos no embrião em desenvolvimento e como discriminar entre os quatro estágios larvais. Finalmente, você aprenderá como configurar uma cruz genética e visitaremos algumas aplicações que manipulam o desenvolvimento e a reprodução de C. elegans para benefício experimental.
Procedure
Caenorhabditis elegans é um organismo multicelular anatomicamente pequeno e geneticamente simples com um padrão invariante de desenvolvimento. Apesar de outros organismos, como vertebrados, terem programas de desenvolvimento mais variáveis, pesquisas sobre desenvolvimento e reprodução de vermes produziram insights importantes sobre os mecanismos moleculares que regulam o desenvolvimento em uma variedade diversificada de espécies, incluindo nós. Uma boa apreciação do desenvolvimento de vermes e seu ciclo de vida é fundamental para o sucesso de experimentos genéticos.
Primeiro, vamos aprender sobre os principais aspectos do desenvolvimento de vermes. Após a fertilização, o primeiro grande evento é uma divisão celular assimétrica durante a qual o eixo anterior-posterior é estabelecido. O eixo dorso-ventral é estabelecido entre o estágio de duas células e quatro células, e o eixo esquerda-direita é estabelecido logo após o estágio de quatro células.
Seis células fundadoras aparecem durante as cinco primeiras rodadas da divisão celular. Estes são AB, MS, E, C, D e P4. Em cada verme, essas mesmas células fundadoras sempre darão origem aos mesmos tecidos específicos.
Descendentes celulares de AB, em última análise, darão origem a neurônios e tecido faringe. A ESM dá origem a músculos, faringe e neurônios. Células derivadas de E tornam-se tecido intestinal. C dá origem a músculos, neurônios e pele. Células do fundador D tornam-se músculos da parede corporal. E, finalmente, a célula P4 dará origem à germinação
As interações célula-células são fundamentais para determinar esses destinos celulares finais. Por exemplo, a interação de ABp com P2 é importante para dar origem a neurônios e células epiteliais. A interação da ABa com a EMS é necessária para a formação de células faringeais. A interação entre o lado posterior do EMS e P2 no estágio de quatro células é essencial para a célula E produzida a partir da célula EMS para se diferenciar em células intestinais.
Seguindo as poucas divisões iniciais, quando o embrião atinge aproximadamente o estágio de 30 células, o ovo de verme é colocado. Outras divisões celulares levam a um aumento no número de células e formação de órgãos. Finalmente, o pequeno verme começa a se mover dentro da casca de ovo, e logo após sua faringe começar a bombear, o ovo choca.
Um aspecto importante do desenvolvimento de C. elegans é a apoptose, ou morte celular programada, que leva à remoção seletiva de certas células. Durante a fase embrionária do desenvolvimento de vermes, 113 células morrem como resultado da apoptose.
Depois de revisar o desenvolvimento embrionário, vamos aprender sobre o ciclo de vida de um verme recém-nascido. O ciclo de vida C. elegans compreende quatro estágios larvais — L1, L2, L3, L4 — que são seguidos pela idade adulta. Sob certas condições ambientais, como a escassez de alimentos, as larvas L1 ou L2 tardias prendem e entram em um programa alternativo de desenvolvimento, chamado de fase dauer. Os dauers podem ficar nesta fase por muitos meses, mas após a disponibilidade de alimentos eles reentram no programa de desenvolvimento normal.
Vermes têm dois sexos - as hermafroditas auto-fertilizantes e machos. As hermafroditas têm uma cauda pontiaguda e ambos são mais largos e mais longos do que os homens com idade. Sob um microscópio dissecando, os machos são facilmente distinguidos por seu corpo magro, mas a diferença mais profunda é a cauda distinta do verme macho que carrega o aparelho copulatório.
A germinação hermafrodita produz tanto oócitos quanto espermatozoides, enquanto o germe masculino produz apenas espermatozoides. A germina contém células-tronco na ponta distal, que se movem em direção ao final proximal para produzir gametas maduros.
Através da auto-fertilização, uma hermafrodita adulta produz prole hermafrodita geneticamente idêntica com dois cromossomos sexuais. Ocasionalmente, a não-adisjunção, que é a falha dos cromossomos de se separar adequadamente na germinação hermafrodita, resulta em prole masculina com apenas um cromossomo sexual. Alta temperatura aumenta a frequência de eventos de não-adisjunção
Acredita-se que a reprodução sexual seja a força motriz da diversidade genética. Embora o acasalamento ocorra em baixa frequência, a auto-fertilização é o principal modo de reprodução em C. elegans na natureza. Uma importante pergunta sem resposta na biologia dos vermes é por que os machos foram preservados através da evolução.
Agora que você aprendeu um pouco sobre o desenvolvimento de C. elegans e o ciclo de vida, vamos ver como podemos praticamente aplicar esse conhecimento para criar cruzes genéticas. Antes de começar, é importante planejar a estratégia genética com cuidado.
A técnica asséptica é importante para evitar contaminação bacteriana e fúngica. Não deixe as placas secarem, pois as cepas de vermes podem ser impossíveis de recuperar. No dia da criação de um acasalamento, prepare várias placas com um ponto concentrado de bactérias no centro da placa. Rotule a placa com nomes de tensão e data. Para configurar um acasalamento, coloque três hermafroditas L4 ou jovens adultos e doze L4 ou jovens adultos em cada prato. Incubar na temperatura apropriada e verificar as placas quatro dias depois para progênero cruzado. A presença de aproximadamente 50% do sexo masculino é o primeiro indício de que a cruz funcionou. Escolha a prole cruzada de hermafrodita L4, pois estas ainda não acasalaram com nenhum macho na placa. Siga-os de perto para garantir que o fenótipo observado corresponda ao fenótipo esperado.
A compreensão do ciclo de vida e desenvolvimento de C. elegans ajudou a abordar questões fundamentais importantes na biologia celular.
A apoptose na germinação é parte integrante da oogênese, embriogênese e organogênese em muitos organismos, incluindo humanos. Muitos reguladores da apoptose são conservados entre humanos e vermes. Portanto, C. elegans é um sistema único para entender por que tantas células germinativas morrem durante a oogênese em diversas espécies.
As únicas linhas de células-tronco de boa fé em C. elegans são as células-tronco germinas na ponta distal. Estes têm sido usados como paradigma para entender como os nichos de células-tronco são mantidos e como as células se comprometem com a diferenciação.
Muitos nematoides parasitas que infectam humanos passam por prisão larval semelhante ao dauer stage em C. elegans. Após a infecção, eles retomam o desenvolvimento. Muitas culturas agrícolas também são invadidas por nematoides parasitas que prendem. Uma melhor compreensão dos mecanismos dauer levará a melhores terapias contra esses nematoides.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao desenvolvimento e reprodução de C. elegans. Neste vídeo, revisamos o desenvolvimento embrionário, a especificação do destino celular e o ciclo de vida de C. elegans. Pesquisas nessas áreas têm gerado importantes insights sobre os mecanismos de apoptose, células-tronco e nematoides infecciosos.
Obrigado por assistir, e boa sorte com sua pesquisa C. Elegans.
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