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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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C. elegans Test di chemiotassi

Overview

La chemiotassi è un processo in cui cellule o organismi si muovono in risposta a uno stimolo chimico. In natura, la chemiotassi è importante per gli organismi per percepire e muoversi verso fonti di cibo e allontanarsi da stimoli che possono essere tossici o dannosi. La chemiotassi è importante anche a livello cellulare. Ad esempio, la chemiotassi è necessaria per il movimento dello sperma verso un uovo prima della fecondazione. In laboratorio, la chemiotassi viene spesso esaminata nel nematode, C. elegans, che è noto per migrare verso fonti di cibo nel suolo, ma lontano da tossine come metalli pesanti, sostanze con un pH basso e detergenti. Questo video dimostra come eseguire un test di chemiotassi, che include la preparazione delle piastre di chemiotassi e dei vermi, l'esecuzione del test e l'analisi dei dati. Quindi, discutiamo esempi di come i test di chemiotassi possono essere utilizzati in C. elegans come strumento per comprendere l'apprendimento e la memoria, l'adattamento olfattivo e le malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer. Gli esperimenti di chemiotassi in C. elegans hanno possibilità quasi illimitate per saperne di più sui meccanismi cellulari e genetici di molti processi biologici e possono portare a una maggiore comprensione della biologia, dello sviluppo e della malattia umana.

Procedure

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Il movimento di una cellula o di un organismo in risposta a uno stimolo chimico è un comportamento chiamato chemiotassi. In questo video, impareremo come eseguire un test di chemiotassi usando il nematode, C. elegans. Discuteremo anche di come i test di chemiotassi in C. elegans vengono applicati allo studio dell'apprendimento e della memoria, dell'adattamento olfattivo e del morbo di Alzheimer.

Discutiamo prima di due diversi tipi di chemiotassi. Il movimento verso uno stimolo chimico è chiamato chemiotassi positiva. Al contrario, il movimento lontano da uno stimolo chimico è chiamato chemiotassi negativa, consentendo agli organismi di allontanarsi dalle sostanze chimiche nocive.

La chemiotassi può verificarsi a livello di organismo, quando gli organismi si muovono verso una fonte di cibo. La chemiotassi avviene anche a livello cellulare, all'interno degli organismi. Ad esempio, le cellule immunitarie migrano verso agenti patogeni o siti di infiammazione. In un altro esempio, gli spermatozoi si muovono verso l'uovo in risposta a un chemio-attrattivo rilasciato dall'uovo. La chemiotassi è anche un processo importante durante lo sviluppo, in cui le cellule migrano in risposta a uno stimolo chimico, formando tessuti e organi nell'organismo in via di sviluppo.

Per C. elegans selvatico, che vive nel suolo, la chemiotassi è importante per il rilevamento e il movimento verso i batteri, la loro principale fonte di cibo. Al contrario, C. elegans è respinto da metalli pesanti, sostanze con un pH basso e detergenti, che sono tossici per l'organismo.

I saggi di chemiotassi in genere iniziano preparando piastre di chemiotassi. Usando un righello e un pennarello, dividere una piastra di 5 cm con mezzo di crescita del nematode in quattro quadranti uguali. Quindi, disegna un cerchio con un raggio di 0,5 cm attorno al centro del quadrante. Questo sarà il punto di partenza per i vermi. Contrassegnare ed etichettare un punto in ogni quadrante, in modo tale che ogni punto sia equidistante dal centro e l'uno dall'altro.

Quando si preparano i vermi per il test, è fondamentale utilizzare vermi giovani adulti sincronizzati con l'età in modo che le differenze nella chemiotassi non siano un artefatto della fase di sviluppo. Una volta sincronizzati i vermi, raccoglierli prima pipettando 2 ml di tampone S-basale su una piastra contenente giovani adulti. Ruotare e inclinare il piatto per lavare i vermi dal piatto.

Quindi, pipettare la soluzione worm/S-basale in un tubo microcentrifuga. Lavare i vermi centrifugando brevemente la soluzione worm/S-basal, rimuovendo il surnatante e aggiungendo un altro millilitro di soluzione S-basale al pellet di verme. Invertire il tubo e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo il lavaggio, rimuovere tutti tranne circa 100 μl della soluzione S-basale. Quindi, aggiungere 2 μl della miscela worm/S-basale a una piastra NGM. Usando un microscopio, conta il numero di vermi presenti. Idealmente, ci saranno tra 50-250 vermi per 2 μl di S-basale.

Ora che le piastre di chemiotassi e i vermi sono pronti, possiamo iniziare il test di chemiotassi. In primo luogo, mescolare volumi uguali della soluzione di prova con 0,5 M di sodio azide, un anestetico che paralizzerà i vermi una volta raggiunta la loro destinazione. Fai lo stesso con la tua soluzione di controllo. Successivamente, pipettare 2 μl di miscela verme / S-basale sul centro della piastra di chemiotassi. Quindi, pipettare 2 μl della soluzione di prova o di controllo e posizionare su punti opportunamente etichettati sulla piastra di chemiotassi. Una volta che le soluzioni di prova e controllo sono state assorbite, rimettere il coperchio, invertire la piastra e impostare un timer per 1 ora.

Dopo che ai vermi è stata data un'ora per rispondere agli stimoli chimici sulla piastra, i dati possono essere analizzati. Contare manualmente il numero di worm all'interno di ciascun quadrante. Se i vermi sono attratti dalla sostanza chimica in esame, ci saranno più vermi presenti in quei quadranti. Se sono neutri nei confronti di quella sostanza chimica, i vermi saranno presenti in ogni quadrante allo stesso modo.

Utilizzare questi dati per calcolare l'indice chemiotattico, che è il numero di vermi nei quadranti di test meno il numero di vermi nel quadrante di controllo, diviso per il numero totale di vermi. Un indice chemiotattico vicino a +1 suggerisce attrazione, mentre un indice chemiotattico vicino a -1 indica repulsione.

Ora che abbiamo imparato come impostare un test di chemiotassi, diamo un'occhiata a come questi esperimenti vengono applicati per rispondere a domande scientifiche.

Uno dei modi in cui sono stati applicati i saggi di chemiotassi in C. elegans è per lo studio dell'apprendimento e della memoria. Ad esempio, i vermi possono essere condizionati ad associare uno stimolo chimico a una fonte di cibo. I vermi ben nutriti sono affamati per un'ora, e poi sono condizionati con il cibo, così come una sostanza chimica come il butanone.

Successivamente, i vermi sono tenuti su un piatto con cibo, ma senza butanone. L'esecuzione di un test di chemiotassi determinerà quindi se i vermi hanno imparato ad associare il butanone al cibo. Molte varianti di questo esperimento possono essere eseguite per determinare altre informazioni come quali geni o neuroni sono importanti per l'apprendimento e la memoria.

L'adattamento olfattivo è un fenomeno che si verifica quando i neuroni sensoriali diminuiscono la loro risposta a uno stimolo nel tempo, consentendo all'animale di rispondere ad altri stimoli, forse più importanti. Ad esempio, I C. elegans selvatici esposti a un odore per un periodo di tempo, ignoreranno quell'odore durante un test di chemiotassi a causa dell'adattamento olfattivo, piuttosto che essere attratti da esso. Pertanto, è possibile eseguire screening genetici ad alto rendimento per rivelare i regolatori genetici dell'adattamento olfattivo, come egl-4. Inoltre, i vermi transgenici che esprimono proteine marcate in modo fluorescente possono essere osservati per i cambiamenti nella localizzazione durante l'adattamento olfattivo.

Infine, i test di chemiotassi possono essere utilizzati in C. elegans per studiare la malattia di Alzheimer. Gli scienziati possono esprimere il peptide beta amiloide umano marcato in modo fluorescente - un segno distintivo della malattia di Alzheimer - nei neuroni di C. elegans. È interessante notare che i test di chemiotassi hanno rivelato che i vermi che esprimono l'amiloide-beta in una popolazione di neuroni mostrano una chemiotassi ridotta verso un attrattivo chemio rispetto al controllo. Molte varianti di questo esperimento potrebbero essere eseguite, tra cui l'espressione di amiloide-beta in altre popolazioni di neuroni o tessuti, o determinare se alcuni composti possono alleviare gli effetti dell'espressione dell'amiloide-beta, portando infine a una potenziale terapia.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla chemiotassi in C. elegans. In primo luogo, abbiamo definito cos'è la chemiotassi e perché è importante in natura per organismi e cellule. Quindi abbiamo dimostrato come eseguire un test di chemiotassi con C. elegans. Infine, abbiamo discusso di come la chemiotassi può essere applicata per comprendere l'apprendimento e la memoria, l'adattamento olfattivo e il morbo di Alzheimer. Grazie per l'attenzione!

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