Summary
Overview
Eine der Hauptvorteile des Arbeitens mit Zebrabärblingen (Danio rerio) ist dass ihre Genetik leicht durch die Mikroinjektion von Embryonen im Frühstadium verändert werden kann. Mit diesem Verfahren können Lösungen, welche genetisches Material oder Genabschaltungskonstrukte enthalten, in die Blastomeren eingefügt werden: also in die embryonalen Zellen, welche auf dem Dottergelb des neu befruchteten Eies sind. Die Lieferung in das Zytoplasma erfolgt entweder durch die direkte Injektion in den Blastomer, oder durch natürliche zytoplasmatische Bewegungen, die nach der Injektion in das Dottergelb, auftreten. Nach erfolgreichen genetischen Manipulationen quantifiziert man normalerweise die embryonalen Phänotypen, um die genetischen Mechanismen der Entwicklung zu verstehen.
Dieses Video gibt eine Einführung in Mikroinjektionsverfahren in Zebrabärblingsembryos. Diese Einführung wiederholt zuerst die grundlegenden Komponenten für dieses Verfahren, einschließlich der Injektionsausrüstung und dem Mikroinjektor, welcher die Bewegung der Flüssigkeit mit Luftdruckpulsen kontrolliert. Danach werden die wichtigsten Schritte zur Vorbereitung eingeführt, wie zum Beispiel das Gießen der Agarplatten, um die Embryonen während der Injektion stabil zu halten, und der Kalibrierung der Mikroinjektionsausrüstung. Danach wird das Injektionsverfahren erläutert, und wir geben wichtige Hinweise wann und wo Injektionen ausgeführt werden sollen. Zum Schluss werden Anwendungen des Mikroinjektionsverfahrens erläutert, wie beispielsweise die Überexprimierung eines Gens mit mRNA, die Genabschaltung durch die Einfügung von Morpholino Oligonukleotiden, und die Herstellung von transgenen Zebrabärblingen mit speziell gestalteter Plasmid-DNA.
Procedure
Mikroinjektionen von Zebrabärblingen ermöglichen es Forschern Lösungen direkt in den sich entwickelnden Embryo einzufügen, um die Genfunktion und die Entwicklungsdynamik zu untersuchen. Embryos des 1-4 Zellenstadiums werden oft für die Injektion benutzt. Da es keine separierenden Membranen gibt, welche den Dottersack und die Zellen in diesem zeitigen Stadium trennt, werden Lösungen direkt entweder in eine Zelle oder in den Dottersack gespritzt und verbreiten sich dann durch den ganzen Organismus. Durch die Mikroinjektionen können proteinproduzierende Gene exprimiert oder ausgeschaltet werden, abhängig von dem Material was man injiziert. Dieses Video zeigt die Vorbereitung der Pipette, das Gewinnen der Embryos und das Mikroinjektionsverfahren. Außerdem zeigen wir wie dieses Verfahren heute in Labors weltweit benutzt wird.
Zuerst schauen wir uns die Hauptbestandteile des Mikroinjektionssystems an: das Stereoskop, den Mikroinjektor, den Pipettenhalter, und den Mikromanipulator.
Der Mikroinjektor liefert ein präzises Volumen durch verschiedene Pulse von Druckluft, welche durch den Benutzer eingestellt werden können. Der Pipettenhalter sichert die Pipette für die Verwendung während der Prozedur und ist mit der Luftröhre des Injektors verbunden. Die Pipettenhalterung wird normalerweise in einen Mikromanipulator gestellt. Dieses Instrument ermöglicht es Forschern kleine und genaue Einstellungen der Pipettenposition während des Injektionsverfahrens vorzunehmen. Ein Fußpedal ist mit dem Injektor verbunden und ermöglicht es dem Forscher beide Hände zu benutzen und gleichzeitig den Druckpuls für die Lieferung des Injektionsmaterials zu aktivieren. Das Stereoskop ermöglicht es dem Forscher den Embryo zu sehen und den Ort der Pipette während des Mikroinjektionsverfahrens zu lokalisieren.
Bevor die Mikroinjektion anfängt, müssen Glasnadeln vorbereitet werden. Mikroinjektionsnadeln müssen aus einer festgelegten Größe bestehen, um das Injektionsmaterial genau abzuliefern. Ein Pipettenzieher hilft dabei feine und scharfe Pipetten jedes Mal herzustellen. Der Zieher wärmt ein Glaskapillarröhrchen und bei gleichzeitiger Anwendung von Kraft wird das Röhrchen gezogen, was zu Herstellung von zwei Pipettennadeln führt. Unter dem Mikroskop wird mit einer Pinzette die Spitze so abgeschnitten, dass ein konstantes Flüssigkeitsvolumen pipettiert werden kann, wobei die Schärfe der Nadel für das Durchdringen des Zebrabärblingembryos erhalten bleibt.
Der Farbstoff Phenolrot hilft dabei die Injektionsprozedur zu visualisieren, und kann in die Injektionslösung gegeben werden, um die erfolgreiche Injektion des Embryos zu verfolgen. Die Nadeln werden dann mit der Injektionslösung von der Seite der Spitze durch Kapillarkraft geladen, oder sie können von hinten mit einer Mikrobeladespritze gefüllt werden. Wenn die Nadel erst einmal für die Mikroinjektion geladen ist, kann sie in den Pipettenhalter des Mikromanipulators eingefügt werden.
Nachdem die Injektionsnadeln bereit sind, werden der Mikroinjektordruck und die Zeiten eingestellt, um jede Nadel zu kalibrieren, was die Lieferung eines gleichen Volumens für jeden Embryo sicherstellt. Unter dem Stereoskop wird ein kleines Volumen einer Lösung in einen Tropfen Mineralöl auf einem Objektträger injiziert. Die Größe des Tropfens wird gemessen und das Volumen, was durch die Nadel verteilt wird, kann berechnet werden. Danach wird der Druck des Mikroinjektors nochmals eingestellt. Dieser Prozess wird wiederholt bis ein Tropfen der gewünschten Größe regelmäßig erhalten wird.
Wenn die Nadeln vorbereitet und kalibriert sind, müssen die Embryos für die Injektion gewonnen und vorbereitet werden. Die Embryos müssen vorsichtig positioniert und während der Injektion mit einer Mikroinjektionskammer festgehalten werden. Um eine Mikroinjektionskammer herzustellen, werden Formen in eine Petrischale gelegt und geschmolzene Agarose in die Schale gegossen bis sie sich verfestigt hat.
Nachdem es fest geworden ist, wird die Form entfernt und das Embryomedium darauf gegossen. Die Embryos werden dann in Rinnen aufgereiht, welche durch die Form und die Transferpipette entstanden sind. Eine Alternative zu dem Aufreihen der Embryos in Agarose ist es sie am Rand eines Objektträgers aufzureihen, so dass sie in einer Reihe für die Mikroinjektion positioniert sind.
Wenn sie erst einmal in Position gebracht worden sind, sind die Embryos bereit für die Injektion. Embryonen können entweder in das Dottergelb oder das Zellzytoplasma injiziert werden. Injektionen in das Dottergelb sind einfacher und erfordern weniger anspruchsvolle Injektionsverfahren. Injektionen in das Zytoplasma sind schwieriger, aber resultieren dafür in robustere Resultate.
Um in das Dottergelb zu injizieren, benutzt man den Mikromanipulator und bewegt die Nadel, so dass sie das Chorion um das Dottergelb herum durchbricht. Dass Fußpedal wird dann betätigt, um den Inhalt der Nadel in das Dottergelb zu entleeren. Der zytoplasmatische Fluss und die Diffusion ermöglichen den Fluss der Injektionslösung in die Zelle. Injektionen in das Zytoplasma erfordern eine vorsichtige Positionierung des Embryos, so dass das Zytoplasma effektiv getroffen werden kann.
Nach der Injektion werden die Embryos in eine neue Schale transferiert und bei 28.5°C inkubiert. Man kontrolliert sie oft und entfernt die toten Embryos. Um den Erfolg der Injektion zu bestimmen, müssen die Embryos mit Hinblick auf ihren allgemeinen Zustand, auf die Anwesenheit eines fluoreszenten Markers, oder auf Veränderungen in ihrem Genom durch Genotypisierung, untersucht werden.
Nun dass ihr versteht wie man Zebrabärblingsembryonen injiziert, schauen wir uns an wie Wissenschaftler diese Methode benutzen können, um die Funktion von Genen zu verstehen.
Erstens können Wissenschaftler künstlich hergestellte mRNA injizieren, um bestimmte Gene zu exprimieren und dann einen Phänotyp zu untersuchen. Das selbe Verfahren kann auch verwendet werden, um Proteine zu exprimieren, die molekulare Ereignisse hervorheben, wie zum Beispiel die zytoskeletaren Umgestaltungen, die während der Entwicklung auftreten.
Zweitens können Gene durch die Injektion von Morpholinos ausgeschaltet werden. Morpholinos sind stabile, künstlich hergestellte Nukleinsäurenanaloga, die so gestaltet worden sind, dass sie spezifische mRNA Sequenzen durch die normale Nukleinsäurenbasenpaarung binden können, und dadurch die Translation blockieren. Dass führt dann zu dem Verlust der Proteinexpression der mRNA. Dieser Effekt ermöglicht es Forschern die Funktion eines bestimmten Gens in der Entwicklung anzuschauen, indem man die Entwicklung in der Abwesenheit des Gens beobachtet.
Injektionen können benutzt werden, um Fremd-DNA in Zebrabärblinge einzufügen. Durch die Injektion von Sequenzen, welche Erkennungssequenzen für DNA-modifizierende Enzyme enthalten, können Wissenschaftler effizient transgene Fische mit modifizierten Genomen generieren. Das heißt, dass fremde Gene auf zukünftige Generationen übertragen werden können. Abhängig von der Sequenzgestaltung, kann die Genexpression auf spezifische Gewebe und Entwicklungszeitpunkte beschränkt werden.
Das war die Einführung in die Mikroinjektion von frühen Zebrabärblingsembryos von JoVE. Dieses Video hat den Mikroinjektionsaufbau eingeführt, gezeigt wie man Mikroinjektionsnadeln und die Embryonen für die Mikroinjektion vorbereitet, wie man das Mikroinjektionsverfahren ausführt, und welche Anwendungen es für die Mikroinjektion gibt. Wie immer, danke für eure Aufmerksamkeit!
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