Overview
אחד היתרונות העיקריים בעבודה עם דגי זברה (דניו rerio) הוא כי הגנטיקה שלהם ניתן לתמרן בקלות על ידי microinjection של עוברים בשלב מוקדם. באמצעות טכניקה זו, פתרונות המכילים חומר גנטי או מבנים נוקאאוט מועברים לתוך blastomeres: התאים העובריים יושבים על החלמון של הביצית מופרית לאחרונה. משלוח לתוך הציטופלסמה מושגת באמצעות הזרקה ישירה לתוך blastomere, או באמצעות תנועות ציטופלסמיות טבעיות המתרחשות לאחר פתרון מוזרק לתוך החלמון. מניפולציות גנטיות מוצלחות בדרך כלל ואחריו כימות של פנוטיפים עובריים על מנת להדגיש את המנגנונים הגנטיים של התפתחות.
וידאו זה יספק מבוא לביצוע מיקרו-טג'ים בעוברי דגי זברה. הדיון מתחיל בסקירה של הכלים החיוניים לטכניקה, כולל מנגנון ההזרקה והמיקרו-נג'ר, השולט בתנועת הנוזלים עם פולסים של אוויר. לאחר מכן, צעדי הכנה חשובים מודגמים, כגון שפיכת לוחות אגר כדי לייצב עוברים במהלך הזרקה וכיול של מנגנון המיקרו-יז'ק. הליך ההזרקה מוצג לאחר מכן יחד עם טיפים על מתי ואיפה זריקות צריך להתבצע. לבסוף, יישומים של טכניקת microinjection נדונים, כולל ביטוי יתר של גנים באמצעות הזרקת mRNA, השתקת גנים על ידי משלוח של oligonucleotides מורפולינו antisense, ואת הדור של דגי זברה מהונדסים באמצעות DNA plasmid מהונדס במיוחד.
Procedure
מיקרו-ערך של עוברים של דגי זברה מאפשר לחוקרים לספק פתרונות ישירות לחיה המתפתחת, על מנת לחקור את תפקוד הגנים ואת הדינמיקה ההתפתחותית. עוברים משלב 1 עד 4 תאים משמשים לעתים קרובות להזרקה. מכיוון שאין ממברנות המפרידות בין התאים לחלמון בשלב מוקדם זה, פתרונות המוזרקים לתא אחד או לחלמון יתפשטו באופן שווה ברחבי האורגניזם. באמצעות מיקרו-ינון, גנים לייצור חלבונים יכולים לבוא לידי ביטוי, או לכבות, בהתאם לסוג החומר המוזרק. וידאו זה ידגים הכנת פיפטה, איסוף עוברים, הליך microinjection, ולדון בכמה מהדרכים טכניקה זו משמשת במעבדות היום.
ראשית, בואו לכסות את המרכיבים העיקריים של מערכת microinjection: סטריאוסקופ, מיקרו-זרם, מחזיק פיפטה, ומיקרו-מניפולטור.
המיקרו-נג'ר מספק נפח מדויק באמצעות פולסים של אוויר, אשר ניתן להתאים על ידי המשתמש. מחזיק הפיפטה מאבטח את הפיפטה לשימוש במהלך ההליך ומחבר אותה לחברת התעופה של המזרק. בדרך כלל, מחזיק הפיפטה ממוקם במיקרו-מניפולטור. מכשיר זה מאפשר לחוקר לבצע התאמות קטנות ומדויקות למיקום הפיפטה במהלך הליך ההזרקה. דוושת כף הרגל מחוברת למזרק ומאפשרת לחוקר לשמור על שימוש בידיים ובמקביל להפעיל את פעימת הלחץ לאספקת חומר הזרקה. לבסוף, הסטריאוסקופ מאפשר לחוקר לראות את העוברים ולהתמקד במיקום הפיפטה במהלך הליך המיקרו-ינון.
לפני microinjection יכול להתחיל, מחטי זכוכית חייב להיות מוכן. מחטי מיקרו-ינון חייבות להיות בגודל עקבי כדי לאפשר אספקה מדויקת של חומרי הזרקה. פולר פיפטה מסייע להבטיח פיפטות עדינות וחדות מוכנות בכל פעם. מושך מחמם צינור נימי זכוכית תוך הפעלת כוח שמושך על הצינור, וכתוצאה מכך שתי מחטי פיפטה.
מתחת למיקרוסקופ, באמצעות מלקחיים, הקצה נחתך באופן המאפשר העברת נפח עקבי של נוזל, אך שומר על חדות המחט לפירסינג העובר של דג הזברה.
פנול אדום, צבע המשמש כדי לעזור לדמיין את הליך ההזרקה, ניתן לערבב עם פתרון ההזרקה על מנת לעקוב אחר הזרקה מוצלחת לתוך העובר.
מחטים ניתן לטעון עם פתרון הזרקה מצד הקצה באמצעות פעולה נימית, או שהם יכולים להיות מלאים במזרק microloader. ברגע המחט נטען להזרקה, זה יכול להיות מוכנס לתוך מחזיק pipette על micromanipulator.
לאחר שמחטי ההזרקה מוכנות, לחץ המיקרו-נג'ר והגדרות הזמן מותאמים על מנת לכייל כל מחט, מה שיבטיח שנפח עקבי יועבר לכל עובר. מתחת לסטריאוסקופ, כמות קטנה של פתרון מוזרקת לטיפה של שמן מינרלי על שקופית. גודל הטיפה נמדד וניתן לחשב את הנפח שהמחט מפזרת. לאחר מכן, הלחץ של microinjector ניתן להתאים עוד יותר את התהליך חוזר על עצמו עד טיפה של הגודל הרצוי מתקבל באופן קבוע.
ברגע מחטים מוכנים מכוילים, עוברים מתקבלים ומסודרים להזרקה.
עוברים חייבים להיות ממוקמים בזהירות ומוחזקים נייחים במהלך הזרקה על ידי תא מיקרו-ישיבה. כדי ליצור תא מיקרו-היגיינה, תבניות ממוקמות בצלחת פטרי ואגורוז מותך נשפך לתוך המנה ומותר להקשיח. לאחר שהוא התגבש, התבנית מוסרת ואת מדיום העובר נשפך על גבי. העוברים יכולים להיות בשורה בשוקת שנוצרו על ידי התבנית באמצעות pipette העברה. חלופה אחת להסדרת העוברים באגרוז היא ליישר אותם בשורה לאורך קצה שקופית מיקרוסקופ, כך שהם ממוקמים בעמודה למיקרו-ערך
ברגע שהם נמצאים בעמדה, העוברים מוכנים להזרקה.
עוברים יכולים להיות מוזרקים לתוך החלמון או ציטופלסמה התא. הזרקה לתוך החלמון היא פשוטה יותר ודורש טכניקת הזרקה פחות מתוחכמת, בעוד הזרקה לתוך הציטופלסמה קשה יותר, אבל מניב תוצאות חזקות יותר. כדי להזריק לתוך החלמון, להשתמש micromanipulator כדי להזיז את המחט, כך שהוא חודר את chorion ולאחר מכן את החלמון. לאחר מכן, טפח על דוושת כף הרגל כדי לגרום לתכולת המחט להיות מגורשת לחלמון. זרימה ציטופלסמית ודיפוזיה מאפשרת לפתרון ההזרקה לזרום לתא.
הזרקה לתוך הציטופלסמה דורש מיקום זהיר של העובר, כך הציטופלסמה יכול להיות ממוקד ביעילות.
לאחר ההזרקה, עוברים מועברים למנה חדשה ודגרו ב 28 °C (5 °F). הם נבדקים לעתים קרובות כדי להסיר עוברים מתים.
כדי לקבוע את הצלחת הזריקה, עוברים ניתן לנתח בהתבסס על המראה הכללי שלהם, נוכחות של סמן פלואורסצנטי, ועל ידי חיפוש שינויים בגנום שלהם באמצעות גנוטיפינג.
עכשיו, כשתבינו איך להזריק עוברים של דגי זברה, בואו נראה איך מדענים יכולים להשתמש בטכניקה הזו כדי להבין את תפקוד הגנים.
ראשית, מדענים יכולים להזריק mRNA מסונתז כדי לדכא יתר על המידה גנים מסוימים ולקבוע את תפקידם על ידי התבוננות פנוטיפ. אותה טכניקה יכולה לשמש גם כדי לבטא חלבונים המדגישים אירועים מולקולריים, כגון סידורים מחדש של שלד ציטו המתרחשים במהלך הפיתוח.
שנית, גנים יכולים להיות כבויים על ידי הזרקת מורפולינוס. Morpholinos הם אנלוגים חומצת גרעין סינתטית יציבה שניתן לתכנן לאגד רצפי mRNA ספציפיים על ידי זיווג בסיס חומצת גרעין סטנדרטי, ותרגום בלוק. בתורו, זה מוביל לאובדן החלבון המיוצר על ידי mRNA זה. השפעה זו מאפשרת לחוקרים להבין את תפקידו של גן מסוים בהתפתחות על ידי ראיית האופן שבו ההתפתחות משתנה בהיעדרו.
הזרקה יכולה לשמש לשילוב דנ"א זר לתוך דג הזברה. על ידי הזרקת רצפים המכילים אתרי זיהוי עבור אנזימים לשינוי DNA, מדענים יכולים לייצר ביעילות דגים "מהונדסים" עם גנומים מותאמים, כלומר גנים זרים יועברו לדורות הבאים. בהתאם לעיצוב הרצף, ביטוי גנים יכול להיות מוגבל לרקמות ספציפיות או לנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות.
הרגע צפיתם בהקדמה של ג'וב למיקרו-יז'ן של עוברים מוקדמים של דגי זברה. וידאו זה הציג את ההתקנה microinjection, הדגים כיצד להכין מחטים microinjection, הראה כיצד להכין עוברים עבור microinjection, לבצע את טכניקת microinjection, וכמה יישומים של microinjection. כמו תמיד, תודה שצפית!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
