Overview
Uno dei principali vantaggi di lavorare con i pesci zebra (Danio rerio) è che la loro genetica può essere facilmente manipolata mediante microiniezione di embrioni in fase iniziale. Usando questa tecnica, le soluzioni contenenti materiale genetico o costrutti di abbattimento vengono consegnate nei blastomeri: le cellule embrionali sedute in cima al tuorlo dell'uovo appena fecondato. La consegna nel citoplasma si ottiene attraverso l'iniezione diretta nel blastomero o tramite movimenti citoplasmatici naturali che si verificano dopo che una soluzione è stata iniettata nel tuorlo. Le manipolazioni genetiche di successo sono solitamente seguite dalla quantificazione dei fenotipi embrionali al fine di chiarire i meccanismi genetici dello sviluppo.
Questo video fornirà un'introduzione all'esecuzione di microiniezioni in embrioni di zebrafish. La discussione inizia con una revisione degli strumenti essenziali per la tecnica, tra cui l'apparato di iniezione e il microiniettore, che controlla il movimento del fluido con impulsi di pressione dell'aria. Successivamente, vengono dimostrati importanti passaggi preparatori, come il versamento di piastre di agar per stabilizzare gli embrioni durante l'iniezione e la calibrazione dell'apparato di microiniezione. La procedura di iniezione viene quindi presentata insieme a suggerimenti su quando e dove devono essere eseguite le iniezioni. Infine, vengono discusse le applicazioni della tecnica di microiniezione, tra cui la sovraespressione genica tramite iniezione di mRNA, il silenziamento genico mediante somministrazione di oligonucleotidi morfolino antisenso e la generazione di zebrafish transgenico utilizzando DNA plasmidico appositamente ingegnerizzato.
Procedure
La microiniezione di embrioni di zebrafish consente ai ricercatori di fornire soluzioni direttamente nell'animale in via di sviluppo, al fine di studiare la funzione genica e le dinamiche di sviluppo. Gli embrioni dallo stadio da 1 a 4 cellule sono spesso usati per l'iniezione. Poiché non ci sono membrane che separano le cellule e il tuorlo in questa fase iniziale, le soluzioni iniettate in una cellula o nel tuorlo si diffonderanno uniformemente in tutto l'organismo. Utilizzando la microiniezione, i geni di produzione di proteine possono essere espressi o disattivati, a seconda del tipo di materiale iniettato. Questo video dimostrerà la preparazione della pipetta, la raccolta degli embrioni, la procedura di microiniezione e discuterà alcuni dei modi in cui questa tecnica viene utilizzata nei laboratori di oggi.
Per prima cosa, copriamo i componenti principali del sistema di microiniezione: lo stereoscopio, il microiniettore, il supporto della pipetta e il micromanipolatore.
Il microiniettore fornisce un volume preciso attraverso impulsi di pressione dell'aria, che possono essere regolati dall'utente. Il porta pipetta fissa la pipetta per l'uso durante la procedura e la collega alla compagnia aerea dell'iniettore. In genere, il supporto della pipetta viene inserito in un micromanipolatore. Questo strumento consente al ricercatore di effettuare piccole e accurate regolazioni alla posizione della pipetta durante la procedura di iniezione. Un pedale è collegato all'iniettore e consente al ricercatore di mantenere l'uso delle mani attivando contemporaneamente l'impulso di pressione per l'erogazione del materiale iniettabile. Infine, lo stereoscopio consente al ricercatore di vedere gli embrioni e concentrarsi sulla posizione della pipetta durante la procedura di microiniezione.
Prima che la microiniezione possa iniziare, devono essere preparati aghi di vetro. Gli aghi per microiniezione devono essere di dimensioni costanti per consentire la consegna precisa dei materiali per iniezione. Un estrattore di pipette aiuta a garantire che le pipette fini e affilate vengano preparate ogni volta. L'estrattore riscalda un tubo capillare di vetro mentre esercita una forza che tira sul tubo, risultando in due aghi pipetta.
Al microscopio, usando una pinza, la punta viene tagliata in un modo che consente di consegnare un volume costante di liquido, ma mantiene la nitidezza dell'ago per perforare l'embrione di zebrafish.
Il rosso fenolo, un colorante utilizzato per aiutare a visualizzare la procedura di iniezione, può essere miscelato con la soluzione di iniezione al fine di monitorare il successo dell'iniezione nell'embrione.
Gli aghi possono essere caricati con soluzione iniettabile dal lato della punta tramite azione capillare, oppure possono essere riempiti con una siringa microloader. Una volta caricato l'ago per l'iniezione, può essere inserito nel supporto della pipetta sul micromanipolatore.
Dopo che gli aghi per iniezione sono pronti, le impostazioni di pressione e tempo del microiniettore vengono regolate al fine di calibrare ciascun ago, il che garantirà che venga consegnato un volume costante a ciascun embrione. Sotto lo stereoscopio, una piccola quantità di soluzione viene iniettata in una goccia di olio minerale su un vetrino. Viene misurata la dimensione della goccia e può essere calcolato il volume che l'ago disperde. Successivamente, la pressione del microiniettore può essere ulteriormente regolata e il processo ripetuto fino a ottenere regolarmente una goccia della dimensione desiderata.
Una volta che gli aghi sono preparati e calibrati, gli embrioni vengono ottenuti e disposti per l'iniezione.
Gli embrioni devono essere posizionati con cura e tenuti fermi durante l'iniezione da una camera di microiniezione. Per creare una camera di microiniezione, gli stampi vengono posti in una capsula di Petri e l'agarose fuso viene versato nel piatto e lasciato indurire. Una volta solidificato, lo stampo viene rimosso e il mezzo embrionale viene versato sopra. Gli embrioni possono essere allineati in abbeveratoi creati dallo stampo utilizzando una pipetta di trasferimento. Un'alternativa alla disposizione degli embrioni in agarose è quella di allinearli lungo il bordo di un vetrino per microscopio, in modo che siano posizionati in una colonna per la microiniezione
Una volta che sono in posizione, gli embrioni sono pronti per essere iniettati.
Gli embrioni possono essere iniettati nel tuorlo o nel citoplasma cellulare. L'iniezione nel tuorlo è più semplice e richiede una tecnica di iniezione meno sofisticata, mentre l'iniezione nel citoplasma è più difficile, ma produce risultati più robusti. Per iniettare nel tuorlo, utilizzare il micromanipolatore per spostare l'ago in modo che perfori il corion e quindi il tuorlo. Il pedale viene quindi toccato per far sì che il contenuto dell'ago venga espulso nel tuorlo. Il flusso e la diffusione citoplasmatica consentono alla soluzione iniettabile di fluire nella cellula.
L'iniezione nel citoplasma richiede un attento posizionamento dell'embrione, in modo che il citoplasma possa essere efficacemente mirato.
Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono trasferiti in un nuovo piatto e incubati a 28,5 °C. Sono spesso controllati per rimuovere gli embrioni morti.
Per determinare il successo dell'iniezione, gli embrioni possono essere analizzati in base al loro aspetto generale, alla presenza di un marcatore fluorescente e alla ricerca di cambiamenti nel loro genoma utilizzando la genotipizzazione.
Ora che hai capito come iniettare embrioni di zebrafish, diamo un'occhiata a come gli scienziati possono usare questa tecnica per capire la funzione dei geni.
In primo luogo, gli scienziati possono iniettare mRNA sintetizzato per sovraesprimere determinati geni e determinare la loro funzione osservando il fenotipo. Questa stessa tecnica può anche essere utilizzata per esprimere proteine che evidenziano eventi molecolari, come i riarrangiamenti citoscheletrici che si verificano durante lo sviluppo.
In secondo luogo, i geni possono essere disattivati dall'iniezione di morfolinos. I morfolinos sono analoghi stabili dell'acido nucleico sintetico che possono essere progettati per legarsi a specifiche sequenze di mRNA mediante accoppiamento standard di base di acidi nucleici e traslazione di blocchi. A sua volta, questo porta alla perdita della proteina prodotta da quell'mRNA. Questo effetto consente ai ricercatori di comprendere il ruolo di un particolare gene nello sviluppo vedendo come lo sviluppo viene alterato in sua assenza.
L'iniezione può essere utilizzata per incorporare DNA estraneo nel pesce zebra. Iniettando sequenze contenenti siti di riconoscimento per gli enzimi che modificano il DNA, gli scienziati possono generare in modo efficiente pesci "transgenici" con genomi modificati, il che significa che geni estranei saranno trasmessi alle generazioni future. A seconda del design della sequenza, l'espressione genica può essere limitata a tessuti specifici o a specifici punti temporali di sviluppo.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microiniezione di embrioni precoci di zebrafish. Questo video ha introdotto la configurazione della microiniezione, ha dimostrato come preparare gli aghi per microiniezione, ha mostrato come preparare gli embrioni per la microiniezione, eseguire la tecnica di microiniezione e alcune applicazioni della microiniezione. Come sempre, grazie per aver guardato!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
