木材のパルプ化は、長年にわたって最適化されてきた化学的に集約的なプロセスであり、廃棄物を最小限に抑えたシステムを作り出しています。ただし、このプロセスの出力の一部は、より価値の高い製品を生成するために使用できます。黒酒もその一例です。これは、世界のリグニン生産量の85%を占める主要な化学パルプ化方法であるクラフトプロセスから生成されます1。クラフトプロセス(図1)は、温度(160-200°C)、圧力(120psig)、および白液に含まれる化学物質(水酸化ナトリウムと硫化ナトリウム)を使用して、木質繊維2,3からリグニンを溶解します。黒液には、リグニン、有機酸、多糖類分解副産物が含まれています4。これは、下流の製紙およびパルプ化プロセスに熱エネルギーを提供する回収ボイラーで蒸気を生成し、化学物質を回収するために焼却されます。パルプ化によって生成される黒液の量は、回収ボイラーが効果的に処理できる量を超える可能性があります。黒液を廃液として処分することは、水生動植物に悪影響を与えるため、選択肢にはありません。成長のために黒液を使用できる微生物の応用は、化学回収率の増加と、パルプ化システムの全体的なライフサイクル分析を改善する付加価値製品の生成という点で有益です。リグニン由来モノマーの化学的および生物学的変換により、食品甘味料や香料添加物として使用するバニリンと桂皮酸、プラスチックや樹脂に使用するフェノール、燃料に使用できるシクロヘキサンを製造することに成功しました5。
このパルプ廃棄物の生分解に関する以前の研究は、リグニンの解重合に焦点を当てていました。国際リグニン研究所(ILI)は、毎年4000万〜5000万トンのリグニンが生産されていると報告しています(http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php。そのリグニンのうち、商業産業プロセスに使用されているのはわずか1.5%です6。PhanerochaetおよびTrametes属の白色腐朽菌によって産生されるラッカーゼおよびペルオキシダーゼ酵素によるリグニン解重合は、詳細に研究されてきました7。ノカルディアやロドコッカス8、シュードモナスプチダmt-29、ストレプトマイセスビリドスポラスT7A10などの芳香族化合物を分解することが知られている土壌細菌も、リグニンを分解する能力があることが示されています。パルプ化廃棄物の細菌分解は、一部の細菌がパルプ化廃棄物の廃液11を特徴付ける生理食塩水およびアルカリ性(pH 10-14)条件で繁殖できるため、有望である。リグニンは黒液の主成分ですが、微生物は黒液を構成する他の成分も分解する可能性があります。これらの技術は、リグニンを分解する微生物を同定するだけでなく、パルプ化廃棄物の黒液にさらに処理された成分の代わりに直接適用できる微生物を特定するのに役立ちます。
黒液は、中和とフィルター滅菌を通じて微生物の増殖のために収集および改変されました。微生物増殖要件は、新規リグノセルロース抽出プロトコルによって産生されたリグノセルロース成分に関する最小限の培地増殖実験により、環境微生物分離物について同定されました。増殖培地をガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)で分析し、黒液を唯一の炭素源として成長させた環境微生物分離物の代謝産物を決定しました。これらの技術の組み合わせは、黒液などのパルプ工場廃棄物で増殖した場合の微生物の代謝能力を決定するための評価ツールを提供します。このような技術を使用すると、副産物の生成のために特定の微生物をパルプ工場の廃棄物に適用する価値についての洞察も得られます。
本実験の総合的な目的は、微生物または微生物コンソーシアムが、パルプ製造廃棄物である黒液(Black Liquor)を増殖に利用できる能力、増殖に利用されている黒液の成分、およびこのパルプ製造廃棄物の微生物代謝によって生成される産物を明らかにすることである。これは、パルプ製造廃棄物である黒液を回収し、培地成分として使用できるように調製することで達成される。第2段階として、リグノセルロース成分を抽出し、これを微生物の炭素源要求性を決定するために使用する。
次に、微生物が黒液およびその成分を利用して増殖できるかを確認するため、培地の調製、接種、および微生物増殖の解析を行います。最小培地寒天プレート上の増殖の観察およびGCMSによる解析の結果、環境から分離した微生物が、増殖および代謝産物の合成において黒液を唯一の炭素源として利用することが示されました。この手法は、微生物がパルプ廃棄物を栄養源として増殖できる可能性と、そのような微生物をパルプ工場から直接分離できるのではないかという議論から着想を得たものです。
水酸化ナトリウム漂白などの既存の手法と比較した際のzignalセルロース抽出法の主な利点は、塩化ナトリウム漂白によって高度かつ向上した純度が得られることです。この手法の視覚的な実演は極めて重要です。セルロースおよびGCMSのサンプル調製ステップは、必要となる工程数が多く、またプロセスの完了を確認するために視覚的な判定が必要であるため、習得が困難です。
この手法は、黒液の微生物分解に関する知見を提供するだけでなく、農作物残渣、林業残渣、都市固形廃棄物などのマグノセルロース材料を含む工業廃棄物ストリームにも適用可能です。本手順を開始するには、クラフト蒸解釜に取り付けられた出口バルブから黒液サンプルを滅菌ガラス瓶に回収し、次のステップに進む前に室温まで冷却させます。その後、攪拌子を入れた500 milliliterのビーカーに黒液サンプルを100 milliliters加え、中速で攪拌します。
黒液にリン酸を滴下し、粘性が現れるまで中和します。続いて、すべての黒液溶液を50 mLコニカルチューブに分注し、9,300 Gsで30分間遠心分離します。炭水化物を分離するために、1 mm以下に粉砕したスイッチグラス5 gと攪拌子を500 mLフラスコに入れます。
次に、蒸留水 200 milliliters、亜塩素酸ナトリウム 7.5 grams、および氷酢酸 2.5 millilitersを加えます。フラスコをスターラー上の 80 degrees Celsius に設定したオイルバスに入れ、1時間保持します。その後、さらに 7.5 grams の塩化ナトリウムと 2.5 milliliters の氷酢酸をフラスコに加えます。
前述のステップを2回繰り返した後、80 °Cでさらに30分間